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豆科植物是被子植物中的第三大家族,包括6个亚家族。豆科植物为人类提供了充足的粮食、油料、饲料等,同时提供了观赏价值和药用价值。因此,研究豆科物种具有重要的意义。蒺藜苜蓿作为豆科植物的模式植物,是典型的二倍体植物,具有基因组小、生活周期短、结实率高、遗传转化效率高等优点。此外,蒺藜苜蓿基因组已经测序完成,具有相对完善的突变体库。因此,蒺藜苜蓿正在被广泛深入地研究。叶片是植物光合作用的主要器官,叶片的形成一般分为三个错综复杂的时期:叶片从顶端分生组织的起始,叶片的初级形态建成和叶片的次级形态建成。在一系列基因、小RNA以及多种激素的共同调控下,叶原基建立近-远轴、中-侧轴和基-顶轴极性,原基细胞朝向特定的方向分裂和分化,形成具有完整功能的叶片,此过程包括叶脉、叶柄、小叶、叶片边缘以及托叶等结构的形成。近年来,关于蒺藜苜蓿复叶发育的报道正在逐年增加,但是还有许多调控机理仍不清楚,蒺藜苜蓿复叶发育的调控网络还需完善。在本论文中,我们以豆科模式植物蒺藜苜蓿为研究材料,对KNOTTED-like homeobox基因（KNOX4）调控复叶模式的机理进行了探究;对LATEMERISTEM IDENTITY1（LM/1）调控叶片边缘发育的机制进行了研究;对Blade On Petiole（BOP）调控托叶发育进行了功能研究。本文的主要研究结果如下:1.MtKNOX4调控复叶发育的功能研究我们通过正向遗传学,筛选到叶片复杂性增加的突变体,mtknox4。通过构建MtKNOX4pro:GUS转基因株系,发现MtKNOX4在幼年时期和成年时期的叶片中表达较高。为了研究MtKNOX4的时空表达模式,我们在野生型顶端中进行了原位杂交实验,结果显示,MtKNOX4在叶原基和叶子中有很强的表达水平,MtKNOX4的表达模式也暗示了 MtKNOX4在叶片发育中发挥功能。在蒺藜苜蓿中,过表达KNOXI家族基因可以增加叶片的复杂性,这与mtknox4叶片复杂性增加的表型是类似的。通过qRT-PCR检测,发现MtKNOX2在mtknox4中表达水平上调,于是,我们构建了mtknox2 mtknox4双突变体,后代的叶片表型类似于mtknox4。随后,我们在mtknox4背景下,同时引入mtknox1/2/6,发现多突变体的叶片仍然类似于mtknox4。这表明MtKNOX4行使功能不依赖于STM/BP家族的MtKNOXI。为了进一步验证MtKNOX4的功能,我们在野生型背景下过表达MtKNOX4,发现叶柄和小叶柄的长度明显缩短,这暗示MtKNOX4负调控叶片的复杂性。随后,在同时过表达MtKNOX2和MtKNOX4的株系中,发现该株系中五叶的比例显著降低,这表明MtKNOX2与MtKNOX4存在拮抗作用。通过外源喷施细胞分裂素和qRT-PCR分析,证明MtKNOX4参与细胞分裂素信号转导通路。此外,我们在分子水平上,证明了 MtKNOX4与FCL1存在蛋白的相互抑制作用。通过对mtknox4和fcl1的有性杂交,在遗传上证明了 MtKNOX4和FCL1的拮抗作用。另外,过表达FCL1可以增加叶柄和小叶柄的长度,同时双过表达FCL1和MtKNOX4的植株,叶柄和小叶柄长度介于过表达FCL1和过表达MtKNOX4之间,这再次证明了 MtKNOX4和FCL1的相互拮抗作用。此外,我们在分子和遗传水平证明了MtKNOX4在转录水平调控MtNAM和MtUFO。最后,我们利用反向遗传学分离了mtknox3/5/9/10突变体,四突变体的叶片仍然正常,这暗示了MtKNOX4基因功能的特异性。过表达MtKNOX5呈现叶柄和小叶柄缩短的表型,这与MtKNOX4类似,而过表达MtKNOX3、MtKNOX9和MtKNOX10则不产生这种表型,这表明KNOXⅡ基因家族在功能上具有多样性。2.MtLMI1s在蒺藜苜蓿叶片边缘的功能研究通过反向遗传学,我们分离并鉴定了蒺藜苜蓿中LMI1的两个同源基因,命名为MtLMI1a和MtLMI1b。MtLMI1属于HD-Zip I转录因子家族,具有HD和Leu zipper结构域,作为转录因子,MtLMI1s定位于细胞核,且MtLMI1a与MtLMI1b存在相互作用,暗示二者可能形成复合物发挥功能。我们通过在突变体库中进行筛选获得了 mtlmi1a和mtlmi1b单突变体,它们没有明显表型;而构建的双突变体中,叶片边缘明显变得光滑,扫描电镜观察结果也证实了这一表型。在MtLMI1spro:GUS转基因株系中,MtLMI1a和MtLMI1b都在叶片边缘和叶脉表达。通过原位杂交分析,MtLMI1a在叶片边缘的尖端以及叶脉处表达,而MtLMI1b在叶片边缘锯齿的凹陷处表达,这表明MtLMI1a与MtLMI1b在叶片边缘上表达位置互补,二者协同作用促进叶片边缘锯齿的形成。另外,我们通过遗传转化35Spro:MtLMI1s-GFP来增强植物体内MtLMI1s的活性,发现叶片锯齿的数目增加,并伴随有叶片卷曲的表型。通过分析mtlmi1a mtlmi1b slm1三突变体的叶片边缘表型,发现MtLMI1s调控下游SLM1/生长素模块。通过分析野生型和mtlmi1a mtlmi1b背景下DR5:GUS和DR5:GFP信号的差异,证明 MtLMI1s 通过调控叶边缘生长素的分布来调控叶片边缘锯齿的发育。为了验证MtLMI1s是否直接调控蒺藜苜蓿中生长素转运基因SLM1的表达,我们利用酵母单杂交、原生质体绑定、ChIP-qPCR以及原位杂交等实验,证明了 MtLMI1s对SLM1的直接调控关系。此外,TAS3 ta-siRNA途径MtAGO7参与叶片锯齿深度的发育过程,而MtAGO7负调控MtARF3的表达。mtago7突变,导致叶片锯齿加深,通过分析mtlmi1a mtlmi1b mtago7三突变体以及mtlmi1a mtlmi1b MtARF3mut杂交株系的叶片边缘,我们证明MtLMI1s与MtAGO7所介导的TAS3 ta-siRNA途径相互拮抗,调控叶片边缘的最终形成。另外,边界基因MtNAM突变后的叶片边缘相对光滑,通过分析mtlmi1a mtlmi1b mtnam的叶片边缘表型,发现三突变体比母本的叶边缘更加光滑,证明MtLMI1s与MtNAM协同作用,调控叶片边缘发育。3.MtBOPs调控托叶发育的功能研究托叶形态的多样性,对于植物分类至关重要。托叶的大小、形态和结构多种多样,常见的有叶状托叶、刺状托叶和须状托叶等。托叶功能的多样性决定了它结构的多样性,但是关于托叶的调控机制,我们还知之甚少。在本论文中,我们研究了蒺藜苜蓿中托叶发育的进程。通过正向遗传学筛选,我们得到一个托叶发育异常的突变体leaf-like stipulel（lls1）。LLS1对应蒺藜苜蓿中MtBOP1基因,同时蒺藜苜蓿中还存在另一个同源基因MtBOP2。MtBOP属于NPR1蛋白家族,包括BTB/POZ结构域和4个ANK结构域。mtbop1 mtbop2双突变体与mtbop单突变体相比,托叶转变成叶片的比例增加,这表明MtBOPs基因存在功能冗余,共同调控托叶的属性。此外,我们利用扫描电镜技术,分析和比较了野生型与双突变体托叶原基的起始情况,发现在mtbop1 mtbop2双突变体中,托叶可以起始,但是要晚于野生型,这与双突中托叶起始较晚是一致的。为了进一步研究MtBOPs基因对叶片和托叶发育的影响,我们通过遗传转化得到了 35Spro:MtBOP1-GFP和35Spro:MtBOP2-GFP过表达株系,该转基因株系植株矮小,但是叶片和托叶没有明显表型变化。将过表达MtBOP1/2引入mtbop1 mtbop2双突变体中,可以部分恢复双突变体托叶表型。为了研究MtBOPs的表达模式,我们得到了MtBOPspro:GUS转基因株系。通过GUS显色,发现MtBOP1和MtBOP2表达位置相似,都在托叶中表达。为了更好地研究它们的时空表达模式,我们进行了原位杂交实验,MtBOPs在叶原基的基部表达,这些位置将会发育成为托叶,这也暗示MtBOPs在托叶原基中功能的特异性。SGL1编码维持叶原基不确定性的关键因子,进而控制侧叶的发育。我们在遗传水平上证明MtBOPs与SGL1协同作用,共同调控托叶的起始过程,在分子水平的调控关系还需要进一步研究。