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第一部分经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路在1型糖尿病小鼠心脏中的表达
目的
构建链脲佐菌素(Stretozotocin，STZ)诱导的1型糖尿病(Diabetes mellitus，DM)小鼠模型，探讨经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路在小鼠心脏中的表达。
方法
7-8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ构建1型糖尿病动物模型，小鼠血糖≥16.7mmol/L则可以作为模型组用于实验，同年龄同性别小鼠为正常对照组(Control group，CON)，两组小鼠正常饮食，自由饮水。随后在糖尿病不同时间点测量正常组和模型组的空腹血糖和随机血糖，收集小鼠心脏组织并观察形态；提取小鼠左心组织总蛋白，同时分离核浆蛋白，用蛋白质印迹法(Western blot，WB)检测经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路相关蛋白的表达；免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation ，IP)检测β-catenin与TCF7L2蛋白结合；免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)检测β-catenin、TCF7L2的表达和分布。
结果
1.随着糖尿病时间延长，DM组随机血糖、空腹血糖逐渐上升；CON组随机血糖、空腹血糖稳定。WB结果显示，随着糖尿病病程延长，DM组心脏中activeβ-catenin、TCF7L2表达增高；CON组中β-catenin、TCF7L2表达并无明显变化。说明随着糖尿病时间延长Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路相关蛋白的表达逐渐增加。
2.心肌组织核浆蛋白WB结果显示，与CON组相比，随着糖尿病时间延长，DM组心肌细胞核内activeβ-catenin、TCF7L2表达逐渐增多。免疫组化结果显示，CON组中β-catenin主要分布在心肌细胞连接的闰盘处，TCF7L2则散落分布在少数的心肌细胞核内；DM组中，β-catenin在闰盘和心肌细胞核内均见表达，且核内表达明显增多，说明DM时β-catenin入核增多；DM组心肌细胞核中TCF7L2表达明显增多，与β-catenin趋势一致，免疫组化结果与心肌组织核浆WB结果相符。心肌组织IP结果显示，与CON组相比，DM组β-catenin蛋白和TCF7L2蛋白结合增多。综合上述实验结果提示，1型糖尿病时心脏β-catenin表达增多，并进入细胞核与转录因子TCF7L2结合，激活经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路。
小结
1型糖尿病时，经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路在心脏中持续活化。
第二部分阻断β-catenin/TCF7L2结合对1型糖尿病心肌病的影响
目的
利用β-catenin转录抑制剂(inhibitorsofβ-cateninresponsivetranscription14，iCRT14)和特异性沉默心脏中TCF7L2的腺相关病毒adeno-associatedvirus-TCF7L2shRNA(AAV-TCF7L2 shRNA)阻断β-catenin/TCF7L2通路，研究该信号通路在糖尿病心肌病发生发展中的作用。
方法
(1)β-catenin转录抑制剂iCRT14对糖尿病心肌病的影响：造模方法同第一部分，1型糖尿病造模成功4周、血糖稳定后用于实验。将糖尿病小鼠分为4组：DM组、DM分别给予iCRT142.5、5、10mg/kg(DM2.5，DM5，DM10)组，同性别同周龄正常小鼠为CON组，给予10mg/kgiCRT14的正常小鼠为正常给药组(CON10)，隔天腹腔注射给药1次，分别在连续给药8周、21周测量随机血糖、空腹血糖、葡萄糖耐受实验(Intraperitoneal glucose tolerance test ，IPGTT)。心脏超声心动图检测小鼠心脏功能。随后，收集小鼠心脏、称取重量、观察心脏组织形态，利用HE染色、Masson染色观察病理变化；提取小鼠左心组织总蛋白，WB检测Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路关键蛋白；提取心脏组织RNA，RT-PCR检测通路相关基因β-catenin、Tcf7l2、c-Myc及肥大标志基因NppamRNA水平，免疫荧光检测心脏组织中TCF7L2表达。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitatio，IP)检测心脏β-catenin、TCF7L2结合。染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay，CHIP)检测β-catenin、TCF7L2对下游靶基因c-Myc的调控作用。
(2)特异性沉默心脏TCF7L2表达的AAV-TCF7L2shRNA对糖尿病心肌病的影响：3-4周龄小鼠分别经颈静脉注射AAV-GFP、AAV-TCF7L2shRNA腺相关病毒，随后建立1型糖尿病模型，方法同第一部分。糖尿病18周后测量空腹血糖、随机血糖、IPGTT。心脏超声心动图检测各组小鼠心脏功能。收集小鼠心脏组织，观察形态并称取心脏重量；提取心脏组织总蛋白，WB检测Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路相关蛋白表达，免疫荧光检测TCF7L2表达分布。
结果
1.与DM组相比，iCRT组随机血糖、IPGTT未见明显变化；空腹血糖随着iCRT给药剂量增加明显降低(P＜0.01)。
2.心脏大体观察发现，DM组心脏体积减小，心脏形态不规则。HE结果显示DM组心肌纤维排列紊乱，肌丝扭曲，边界不清，细胞核大小不一。连续给药iCRT148周、21周心脏重量增加(P＜0.01)，形态规则，心肌纤维排列有序，肌丝完整，边界清晰，细胞核大小规整。提示阻断β-catenin/TCF7L2通路能改善糖尿病引起的心肌病理结构改变。
3.超声数据显示，与CON相比，DM组左室舒张期和收缩期前后壁(LVAW；d， LVAW；s， LVPW；s ， LVPW；d )明显变薄(P＜0.01)，二尖瓣血流E峰(MV E)/A峰(MV A)比值降低。连续给药iCRT148周、21周后室壁增厚(P＜0.05)，给药21周后E/A比值增加(P＜0.01)。提示阻断β-catenin/TCF7L2通路可以改善糖尿病心脏舒张功能障碍。
4.WB结果显示，DM组β-catenin/TCF7L2信号通路蛋白的表达和第一部分实验结果一致。和DM组相比，iCRT14组给药8周后active-β-catenin、β-catenin、TCF7L2、c-Myc的表达随着给药浓度增加逐渐降低(P＜0.05)，给药21周后下降更加明显(P＜0.01)。RT-PCR结果显示，DM组β-catenin/TCF7L2信号通路基因Tcf7l2、c-Myc、肥大基因NppamRNA表达上调；iCRT14给药8周后随iCRT14剂量增加Tcf7l2、c-Myc、肥大基因NppamRNA表达降低(P＜0.05)，连续给药21周后上述基因表达显著降低(P＜0.01)。免疫荧光结果显示，和CON组相比，DM组心肌细胞核内TCF7L2表达增多；iCRT14给药8周、21周各剂量组中TCF7L2在细胞核内表达减少，且呈剂量依赖趋势。提示阻断β-catenin/TCF7L2通路可以抑制糖尿病心脏c-Myc表达，降低心肌肥大标志基因表达，改善糖尿病心肌肥厚。
5.IP结果显示，和CON组相比，DM组β-catenin与TCF7L2结合明显增多，给予iCRT14能显著抑制两者结合。Chip结果显示，与CON组相比，DM组内β-catenin、TCF7L2蛋白与c-Myc启动子区域的结合增加(P＜0.01)；给予iCRT14后，β-catenin、TCF7L2与c-Myc启动子区域的结合显著下降(P＜0.01)。说明糖尿病心脏中β-catenin入核与TCF7L2的结合，该信号通路活化；iCRT14能有效阻断β-catenin、TCF7L2结合，抑制Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路活性，从转录水平直接抑制c-Myc表达。
6.糖尿病18周后观察注射病毒组小鼠血糖变化，与DM+AAV-GFP组相比，AAV-TCF7L2shRNA组小鼠空腹血糖、随机血糖、糖耐量无明显变化。
7.大体观察发现，DM+AAV-GFP组小鼠心脏体积下降、形态不规则，糖尿病小鼠感染AAV-TCF7L2shRNA后，心脏形态规整，心脏重量增加(P＜0.01)。提示抑制TCF7L2表达能改善糖尿病引起的心肌病理结构改变。
8.超声数据显示，和CON组对比，DM+AAV-GFP组左室舒张期和收缩期前后壁(LVAW；d， LVAW；s， LVPW；s ， LVPW；d )明显变薄(P＜0.01)，二尖瓣血流E峰(MV E)/A峰(MVA)比值降低(P＜0.01)，DM+AAV-TCF7L2AAV-TCF7L2shRNA组上述指标均增加(P＜0.01)。提示抑制TCF7L2表达可以改善糖尿病心脏舒张功能障碍。
9.免疫荧光结果显示，和CON组相比，DM+AAV-GFP组心肌细胞核内TCF7L2表达增多；AAV-TCF7L2shRNA组中TCF7L2在细胞核内表达明显减少，提示颈静脉注射病毒成功抑制心肌细胞TCF7L2表达。WB结果显示，和DM+AAV-GFP组相比，AAV-TCF7L2shRNA组β-catenin表达无明显变化，activeβ-catenin、TCF7L2、c-Myc表达下降(P＜0.05)。提示抑制TCF7L2能下调c-Myc表达，改善糖尿病心肌的结构和功能。
小结
1．持续激活的经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路在糖尿病心肌病发生发展中发挥重要作用。
2.有效阻断β-catenin/TCF7L2信号通路，能抑制该通路活化，抑制c-Myc表达，改善糖尿病心肌病。
第三部分经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路对高糖诱导的心肌肥大的影响
目的
构建体外心肌细胞高糖模型，利用β-catenin激动剂SKL2001、抑制剂iCRT14，探讨β-catenin/TCF7L2通路对高糖诱导的心肌肥大影响
方法
体外原代培养大鼠乳鼠心肌细胞，随后用33mmol/L葡萄糖(Glucose，GLU)分别处理心肌细胞24h、48h、72h，低糖培养基(5.5 mmol/L)作为CON正常对照组(Control，CON)，等浓度甘露醇(Mannitol，Man)作为渗透压对照组。收集心肌细胞后量取细胞表面积，免疫荧光观察β-catenin、TCF7L2表达分布，提取心肌细胞蛋白WB检测Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路、心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide， ANP)蛋白表达。各组提取RNA后，RT-PCR检测Tcf7l2、c-Myc、NppamRNA表达。
在低糖环境中别给予不同浓度的β-catenin激动剂SKL2001(2.5 ?mol/L、5 ?mol/L、10 ?mol/L、20 ?mol/L、40 ?mol/L、 80 ?mol/L)处理心肌细胞48h，低糖培养心肌细胞为空白对照组。采用MTT法检测各组细胞活性。随后提取各组心肌细胞蛋白，WB检测β-catenin、TCF7L2蛋白表达，根据MTT和WB结果挑选合适的SKL2001浓度。
根据上部分的实验结果，分别使用高糖与SKL200120?mol/L(SKL20)、iCRT145?mol/L、10?mol/L、20?moll/L(iCRT14 5、iCRT14 10、iCRT14 20)处理心肌细胞，低糖培养细胞为CON组，高糖处理细胞为GLU组，处理48小时后提取心肌细胞蛋白WB检测Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路相关蛋白、ANP蛋白表达。
结果
1.免疫荧光结果显示，和CON组对比，GLU处理72小时组细胞表面积增加(P＜0.01)。在CON组中β-catenin分散在心肌细胞连接处、TCF7L2在细胞核中有少量表达；在GLU处理72h组中β-catenin开始在细胞核内聚集，TCF7L2在核内表达增多，与糖尿病小鼠心脏结果相符。WB结果显示高糖组activeβ-catenin、β-catenin、TCF7L2、c-Myc、ANP在48h、72h时增加明显(P＜0.01)。RT-PCR结果显示，随着高糖刺激时间延长，Tcf7l2、c-Myc、Nppa基因表达逐渐升高。提示高糖环境激活心肌细胞Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路，上调c-Myc表达，诱导心肌细胞产生肥大效应。
2.WB结果显示β-catenin激动剂SKL2001处理心肌细胞后，能浓度依赖性诱导β-catenin、TCF7L2表达，其中20?mol/L浓度时蛋白表达达到峰值(P＜0.05)。根据MTT结果，心肌细胞在SKL200120?mol/L时细胞存活率没有明显变化，因此选择SKL200120?mol/L进行后续实验。
3.WB结果显示，和CON组相比，GLU组和SKL20组β-catenin、TCF7L2、c-Myc和肥大标志物ANP蛋白表达增多(P＜0.05)；给予iCRT14后TCF7L2、c-Myc、ANP蛋白表达随给药浓度增加明显降低(P＜0.01)。提示抑制β-catenin/TCF7L2信号通路后可抑制高糖诱导的c-Myc表达，减缓心肌肥大。
小结
持续高糖环境可激活心肌细胞β-catenin/TCF7L2信号通路，上调c-Myc表达，诱导细胞肥大；抑制β-catenin/TCF7L2信号通路可有效改善高糖诱导的心肌肥大。
全文结论：
体内外研究证实，高糖环境能通过激活经典Wnt/β-catenin/TCF7L2通路、上调c-Myc表达，引起糖尿病心肌病；抑制β-catenin/TCF7L2通路能显著改善1型糖尿病小鼠心脏功能、减缓糖尿病心肌病。
目的
构建链脲佐菌素(Stretozotocin，STZ)诱导的1型糖尿病(Diabetes mellitus，DM)小鼠模型，探讨经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路在小鼠心脏中的表达。
方法
7-8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ构建1型糖尿病动物模型，小鼠血糖≥16.7mmol/L则可以作为模型组用于实验，同年龄同性别小鼠为正常对照组(Control group，CON)，两组小鼠正常饮食，自由饮水。随后在糖尿病不同时间点测量正常组和模型组的空腹血糖和随机血糖，收集小鼠心脏组织并观察形态；提取小鼠左心组织总蛋白，同时分离核浆蛋白，用蛋白质印迹法(Western blot，WB)检测经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路相关蛋白的表达；免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation ，IP)检测β-catenin与TCF7L2蛋白结合；免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)检测β-catenin、TCF7L2的表达和分布。
结果
1.随着糖尿病时间延长，DM组随机血糖、空腹血糖逐渐上升；CON组随机血糖、空腹血糖稳定。WB结果显示，随着糖尿病病程延长，DM组心脏中activeβ-catenin、TCF7L2表达增高；CON组中β-catenin、TCF7L2表达并无明显变化。说明随着糖尿病时间延长Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路相关蛋白的表达逐渐增加。
2.心肌组织核浆蛋白WB结果显示，与CON组相比，随着糖尿病时间延长，DM组心肌细胞核内activeβ-catenin、TCF7L2表达逐渐增多。免疫组化结果显示，CON组中β-catenin主要分布在心肌细胞连接的闰盘处，TCF7L2则散落分布在少数的心肌细胞核内；DM组中，β-catenin在闰盘和心肌细胞核内均见表达，且核内表达明显增多，说明DM时β-catenin入核增多；DM组心肌细胞核中TCF7L2表达明显增多，与β-catenin趋势一致，免疫组化结果与心肌组织核浆WB结果相符。心肌组织IP结果显示，与CON组相比，DM组β-catenin蛋白和TCF7L2蛋白结合增多。综合上述实验结果提示，1型糖尿病时心脏β-catenin表达增多，并进入细胞核与转录因子TCF7L2结合，激活经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路。
小结
1型糖尿病时，经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路在心脏中持续活化。
第二部分阻断β-catenin/TCF7L2结合对1型糖尿病心肌病的影响
目的
利用β-catenin转录抑制剂(inhibitorsofβ-cateninresponsivetranscription14，iCRT14)和特异性沉默心脏中TCF7L2的腺相关病毒adeno-associatedvirus-TCF7L2shRNA(AAV-TCF7L2 shRNA)阻断β-catenin/TCF7L2通路，研究该信号通路在糖尿病心肌病发生发展中的作用。
方法
(1)β-catenin转录抑制剂iCRT14对糖尿病心肌病的影响：造模方法同第一部分，1型糖尿病造模成功4周、血糖稳定后用于实验。将糖尿病小鼠分为4组：DM组、DM分别给予iCRT142.5、5、10mg/kg(DM2.5，DM5，DM10)组，同性别同周龄正常小鼠为CON组，给予10mg/kgiCRT14的正常小鼠为正常给药组(CON10)，隔天腹腔注射给药1次，分别在连续给药8周、21周测量随机血糖、空腹血糖、葡萄糖耐受实验(Intraperitoneal glucose tolerance test ，IPGTT)。心脏超声心动图检测小鼠心脏功能。随后，收集小鼠心脏、称取重量、观察心脏组织形态，利用HE染色、Masson染色观察病理变化；提取小鼠左心组织总蛋白，WB检测Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路关键蛋白；提取心脏组织RNA，RT-PCR检测通路相关基因β-catenin、Tcf7l2、c-Myc及肥大标志基因NppamRNA水平，免疫荧光检测心脏组织中TCF7L2表达。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitatio，IP)检测心脏β-catenin、TCF7L2结合。染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay，CHIP)检测β-catenin、TCF7L2对下游靶基因c-Myc的调控作用。
(2)特异性沉默心脏TCF7L2表达的AAV-TCF7L2shRNA对糖尿病心肌病的影响：3-4周龄小鼠分别经颈静脉注射AAV-GFP、AAV-TCF7L2shRNA腺相关病毒，随后建立1型糖尿病模型，方法同第一部分。糖尿病18周后测量空腹血糖、随机血糖、IPGTT。心脏超声心动图检测各组小鼠心脏功能。收集小鼠心脏组织，观察形态并称取心脏重量；提取心脏组织总蛋白，WB检测Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路相关蛋白表达，免疫荧光检测TCF7L2表达分布。
结果
1.与DM组相比，iCRT组随机血糖、IPGTT未见明显变化；空腹血糖随着iCRT给药剂量增加明显降低(P＜0.01)。
2.心脏大体观察发现，DM组心脏体积减小，心脏形态不规则。HE结果显示DM组心肌纤维排列紊乱，肌丝扭曲，边界不清，细胞核大小不一。连续给药iCRT148周、21周心脏重量增加(P＜0.01)，形态规则，心肌纤维排列有序，肌丝完整，边界清晰，细胞核大小规整。提示阻断β-catenin/TCF7L2通路能改善糖尿病引起的心肌病理结构改变。
3.超声数据显示，与CON相比，DM组左室舒张期和收缩期前后壁(LVAW；d， LVAW；s， LVPW；s ， LVPW；d )明显变薄(P＜0.01)，二尖瓣血流E峰(MV E)/A峰(MV A)比值降低。连续给药iCRT148周、21周后室壁增厚(P＜0.05)，给药21周后E/A比值增加(P＜0.01)。提示阻断β-catenin/TCF7L2通路可以改善糖尿病心脏舒张功能障碍。
4.WB结果显示，DM组β-catenin/TCF7L2信号通路蛋白的表达和第一部分实验结果一致。和DM组相比，iCRT14组给药8周后active-β-catenin、β-catenin、TCF7L2、c-Myc的表达随着给药浓度增加逐渐降低(P＜0.05)，给药21周后下降更加明显(P＜0.01)。RT-PCR结果显示，DM组β-catenin/TCF7L2信号通路基因Tcf7l2、c-Myc、肥大基因NppamRNA表达上调；iCRT14给药8周后随iCRT14剂量增加Tcf7l2、c-Myc、肥大基因NppamRNA表达降低(P＜0.05)，连续给药21周后上述基因表达显著降低(P＜0.01)。免疫荧光结果显示，和CON组相比，DM组心肌细胞核内TCF7L2表达增多；iCRT14给药8周、21周各剂量组中TCF7L2在细胞核内表达减少，且呈剂量依赖趋势。提示阻断β-catenin/TCF7L2通路可以抑制糖尿病心脏c-Myc表达，降低心肌肥大标志基因表达，改善糖尿病心肌肥厚。
5.IP结果显示，和CON组相比，DM组β-catenin与TCF7L2结合明显增多，给予iCRT14能显著抑制两者结合。Chip结果显示，与CON组相比，DM组内β-catenin、TCF7L2蛋白与c-Myc启动子区域的结合增加(P＜0.01)；给予iCRT14后，β-catenin、TCF7L2与c-Myc启动子区域的结合显著下降(P＜0.01)。说明糖尿病心脏中β-catenin入核与TCF7L2的结合，该信号通路活化；iCRT14能有效阻断β-catenin、TCF7L2结合，抑制Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路活性，从转录水平直接抑制c-Myc表达。
6.糖尿病18周后观察注射病毒组小鼠血糖变化，与DM+AAV-GFP组相比，AAV-TCF7L2shRNA组小鼠空腹血糖、随机血糖、糖耐量无明显变化。
7.大体观察发现，DM+AAV-GFP组小鼠心脏体积下降、形态不规则，糖尿病小鼠感染AAV-TCF7L2shRNA后，心脏形态规整，心脏重量增加(P＜0.01)。提示抑制TCF7L2表达能改善糖尿病引起的心肌病理结构改变。
8.超声数据显示，和CON组对比，DM+AAV-GFP组左室舒张期和收缩期前后壁(LVAW；d， LVAW；s， LVPW；s ， LVPW；d )明显变薄(P＜0.01)，二尖瓣血流E峰(MV E)/A峰(MVA)比值降低(P＜0.01)，DM+AAV-TCF7L2AAV-TCF7L2shRNA组上述指标均增加(P＜0.01)。提示抑制TCF7L2表达可以改善糖尿病心脏舒张功能障碍。
9.免疫荧光结果显示，和CON组相比，DM+AAV-GFP组心肌细胞核内TCF7L2表达增多；AAV-TCF7L2shRNA组中TCF7L2在细胞核内表达明显减少，提示颈静脉注射病毒成功抑制心肌细胞TCF7L2表达。WB结果显示，和DM+AAV-GFP组相比，AAV-TCF7L2shRNA组β-catenin表达无明显变化，activeβ-catenin、TCF7L2、c-Myc表达下降(P＜0.05)。提示抑制TCF7L2能下调c-Myc表达，改善糖尿病心肌的结构和功能。
小结
1．持续激活的经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路在糖尿病心肌病发生发展中发挥重要作用。
2.有效阻断β-catenin/TCF7L2信号通路，能抑制该通路活化，抑制c-Myc表达，改善糖尿病心肌病。
第三部分经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路对高糖诱导的心肌肥大的影响
目的
构建体外心肌细胞高糖模型，利用β-catenin激动剂SKL2001、抑制剂iCRT14，探讨β-catenin/TCF7L2通路对高糖诱导的心肌肥大影响
方法
体外原代培养大鼠乳鼠心肌细胞，随后用33mmol/L葡萄糖(Glucose，GLU)分别处理心肌细胞24h、48h、72h，低糖培养基(5.5 mmol/L)作为CON正常对照组(Control，CON)，等浓度甘露醇(Mannitol，Man)作为渗透压对照组。收集心肌细胞后量取细胞表面积，免疫荧光观察β-catenin、TCF7L2表达分布，提取心肌细胞蛋白WB检测Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路、心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide， ANP)蛋白表达。各组提取RNA后，RT-PCR检测Tcf7l2、c-Myc、NppamRNA表达。
在低糖环境中别给予不同浓度的β-catenin激动剂SKL2001(2.5 ?mol/L、5 ?mol/L、10 ?mol/L、20 ?mol/L、40 ?mol/L、 80 ?mol/L)处理心肌细胞48h，低糖培养心肌细胞为空白对照组。采用MTT法检测各组细胞活性。随后提取各组心肌细胞蛋白，WB检测β-catenin、TCF7L2蛋白表达，根据MTT和WB结果挑选合适的SKL2001浓度。
根据上部分的实验结果，分别使用高糖与SKL200120?mol/L(SKL20)、iCRT145?mol/L、10?mol/L、20?moll/L(iCRT14 5、iCRT14 10、iCRT14 20)处理心肌细胞，低糖培养细胞为CON组，高糖处理细胞为GLU组，处理48小时后提取心肌细胞蛋白WB检测Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路相关蛋白、ANP蛋白表达。
结果
1.免疫荧光结果显示，和CON组对比，GLU处理72小时组细胞表面积增加(P＜0.01)。在CON组中β-catenin分散在心肌细胞连接处、TCF7L2在细胞核中有少量表达；在GLU处理72h组中β-catenin开始在细胞核内聚集，TCF7L2在核内表达增多，与糖尿病小鼠心脏结果相符。WB结果显示高糖组activeβ-catenin、β-catenin、TCF7L2、c-Myc、ANP在48h、72h时增加明显(P＜0.01)。RT-PCR结果显示，随着高糖刺激时间延长，Tcf7l2、c-Myc、Nppa基因表达逐渐升高。提示高糖环境激活心肌细胞Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路，上调c-Myc表达，诱导心肌细胞产生肥大效应。
2.WB结果显示β-catenin激动剂SKL2001处理心肌细胞后，能浓度依赖性诱导β-catenin、TCF7L2表达，其中20?mol/L浓度时蛋白表达达到峰值(P＜0.05)。根据MTT结果，心肌细胞在SKL200120?mol/L时细胞存活率没有明显变化，因此选择SKL200120?mol/L进行后续实验。
3.WB结果显示，和CON组相比，GLU组和SKL20组β-catenin、TCF7L2、c-Myc和肥大标志物ANP蛋白表达增多(P＜0.05)；给予iCRT14后TCF7L2、c-Myc、ANP蛋白表达随给药浓度增加明显降低(P＜0.01)。提示抑制β-catenin/TCF7L2信号通路后可抑制高糖诱导的c-Myc表达，减缓心肌肥大。
小结
持续高糖环境可激活心肌细胞β-catenin/TCF7L2信号通路，上调c-Myc表达，诱导细胞肥大；抑制β-catenin/TCF7L2信号通路可有效改善高糖诱导的心肌肥大。
全文结论：
体内外研究证实，高糖环境能通过激活经典Wnt/β-catenin/TCF7L2通路、上调c-Myc表达，引起糖尿病心肌病；抑制β-catenin/TCF7L2通路能显著改善1型糖尿病小鼠心脏功能、减缓糖尿病心肌病。