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目的：本研究为“含川楝子的中药复方减毒配伍规律研究”课题的部分研究。在本课题前期川楝子肝毒性研究工作的基础上,本论文对川楝子致肝毒性的机理作进一步探讨,并通过配伍中药白芍考察对川楝子的减毒效应及其机制,以探求减轻川楝子肝毒性的中药复方减毒配伍规律。
方法：
(1)川楝子肝毒性机制研究：中药血清药理学方法考察川楝子含药血清对大鼠原代培养肝细胞的影响；免疫组化法检测大鼠肝组织NF-κBp65及ICAM-1表达。
(2)川楝子对肝药酶的影响:SD大鼠,单次或连续灌胃给予川楝子后,RT-PCR方法检测大鼠肝药酶CYP1A2、2E1-mRNA表达；SD大鼠,连续给予川楝子7天后,药物探针法检测大鼠肝药酶CYP1A2、2E1、3A1的活性。
(3)川楝子减毒配伍研究初探:KM小鼠,分组,单次灌胃给予川楝子及不同药物与川楝子配伍的药液,检测给药后血清ALT、AST活性；计算肝脏指数。
(4)白芍配伍川楝子后毒性的“时效”及“量效”关系研究:KM小鼠或SD大鼠,按不同时间或白芍配伍川楝子不同剂量分组,单次灌胃给予川楝子、川白,检测给药后血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性、碱性磷酸酯酶(ALP);计算肝脏指数；光镜下观察肝组织的病理变化。
(5)白芍配伍川楝子急性减毒机制研究:SD大鼠,分组,单次灌服蒸馏水或川楝子、川白,放射免疫法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)含量、免疫组化法检测核转录因子-κB(NF-κB)、ICAM-1蛋白表达、Western-blot法caspase-3、bcl-2基因表达。
(6)白芍配伍川楝子后对大鼠长期毒性的研究:SD大鼠,分组,连续灌服蒸馏水或川楝子、川白45天,观察给药期间的一般表现,检测给药45天后血清ALT、AST、ALP;计算肝脏指数；光镜下观察肝组织的病理变化。
结果：
(1)川楝子含药血清对大鼠原代培养肝细胞的影响：与正常组比较,川楝子5％、10％含药血清均可导致肝细胞上清液中I,DH、ALT、AST水平不同程度的升高(P<0.05或P<0.01),1h即显效,在24h最为显著,且呈明显的量效关系；大鼠肝组织NF-κBp65及ICAM-1蛋白表达：正常大鼠肝组织较少表达NF-κB3 p65及ICAM-1,主要分布在细胞质中；四氯化碳组则有较强的NF-κB p65及ICAM-1表达,分布在细胞质和(或)细胞核中；川楝子组表达比正常组显著增强(P<0.01)。
(2)川楝子对肝药酶的影响：单次给予川楝子后可使CYP1A2的mRNA表达增加,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.05),但对CYP2E1的mRNA表达无明显的影响；连续给予川楝子45天后,大鼠肝脏CYP2E1表达量增多,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.05),但对CYP1A2的mRNA表达无明显的影响；连续给予川楝子7天后,对肝微粒体CYP1A2活性影响不明显,但可使大鼠肝微粒体酶蛋白含量增加(P<0.05),使肝脏CYP1A2总代谢能力增强(P<0.05);连续给予川楝子7天后,对大鼠肝微粒体CYP2E1活性及代谢能力均无明显影响(P>0.05);连续给予川楝子7天后,川楝子可诱导雌性大鼠肝微粒体CYP3A1,使6β-OH睾酮代谢生成速率及肝脏总代谢睾酮的能力增强(P<0.05);对雄性大鼠肝微粒体CYP3A1有诱导的趋势,使6β-OH睾酮代谢生成速率及肝脏总代谢睾酮的能力有增强的趋势,但与对照组比较差异无显著意义(P>0.05)。
(3)川楝子减毒配伍研究初探：给予川楝子或不同药物与川楝子配伍的合煎药液后,白芍配伍川楝子能降低小鼠血清ALT、AST的升高,与川楝子组比较有显著差异(P<0.05);生地配伍川楝子及复方八物汤有降低小鼠血清ALT、AST升高的趋势,但与川楝子组比较无显著差异(P>0.05)。
(4)白芍配伍川楝子后毒性的“时效”及“量效”关系研究：与正常组比较,给予川楝子后1～2h,血清ALT、AST水平显著提高(P<0.05或P<0.01),与川楝子组比较,白芍与川楝子配伍后2h可显著对抗血清ALT、AST水平的提高(P<0.01);与正常组比较,给予川楝子后2～4h肝脏肿大、肝指数明显升高(P<0.05或P<0.01);给予川楝子或川白后4h,肝组织病理形态学损伤明显。选取不同剂量的白芍与川楝子配伍,当白芍以相当于人临床用量20倍的用量与川楝子配伍时减毒效应最为显著,表现为白芍与川楝子配伍后,小鼠血清ALT明显下降,与川楝子组比较,其差异具有显著性(P<0.01);但白芍对小鼠的肝脏指数及病理形态学无明显的影响(P>0.05)。大鼠灌胃给予川楝子或川白后,川楝子组大鼠ALT、AST、ALP水平明显升高,白芍与川楝子配伍后有降低大鼠血清ALT、AST、ALP水平的趋势,但与川楝子组比较无显著差异(P>0.05)。各组对大鼠肝脏指数没有明显的影响(P>0.05)。
(5)白芍配伍川楝子急性减毒机制研究：大鼠给予川楝子以后,肝组织TNF-α、IL-6水平显著提高,白芍与川楝子配伍后能够对抗肝组织TNF-α、IL-6水平的提高(P<0.05或P<0.01);大鼠给予川楝子以后,NF-κBp65、ICAM-1蛋白表达显著增强,白芍与川楝子配伍后能够对抗肝组织NF-κBp65、ICAM-1蛋白表达的增强(P<0.01)：大鼠给予川楝子以后,Caspase-3基因表达明显增加,Bcl-2基因表达明显下降,白芍与川楝子配伍后能够对抗肝组织Caspase-3基因表达的上调和Bcl-2基因表达的下调。
(6)白芍配伍川楝子后对大鼠长期毒性的研究：灌胃川楝子45天后,大鼠血清ALT、ALP水平提高,与正常组比较有显著性差异(P<0.01);大鼠肝脏指数明显升高,与正常组比较有显著差异(P<0.01);对大鼠肝组织病理形态学未见明显影响(P>0.05)。白芍配伍后能对抗川楝子导致的大鼠血清ALT、ALP的提高,与川楝子组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01);对肝脏指数及肝组织病理形态学未见明显影响(P>0.05)。
结论：
(1)大剂量川楝子可导致急性肝细胞损伤。肝细胞坏死是川楝子肝损害的主要形式。氧化应激和炎症反应可能是川楝子致肝细胞损伤的重要机制。
(2)实验结果显示,川楝子对肝药酶CYP1A2、CYP3A1具有一定的诱导作用。CYP2E1 mRNA表达的显著升高可能与川楝子导致慢性肝损伤的机制有关。
(3)白芍能对抗川楝子导致的肝损伤,其减毒机制是该药可以减轻肝组织的脂质过氧化和炎症反应,并与调节肝细胞坏死相关基因caspase-3、Bcl-2的表达有关。