【摘 要】
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乳酸菌是一类公认安全的食品级微生物,可广泛应用于各种发酵食品、生物医药及精细化学品等领域,具有极高的经济价值,研究乳酸菌生理机制,提升其发酵过程中的生产性能及益生功能,一直是人们关注的焦点.乳酸乳球菌在发酵工业中占20％,是乳制品发酵,尤其是奶酪制作的"主力军".通过代谢工程手段改进乳酸乳球菌生理功能,扩展应用范围,强化其益生性能具有重要意义.以乳酸乳球菌噬菌体(Bacteriophage r1t
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乳酸菌是一类公认安全的食品级微生物,可广泛应用于各种发酵食品、生物医药及精细化学品等领域,具有极高的经济价值,研究乳酸菌生理机制,提升其发酵过程中的生产性能及益生功能,一直是人们关注的焦点.乳酸乳球菌在发酵工业中占20％,是乳制品发酵,尤其是奶酪制作的"主力军".通过代谢工程手段改进乳酸乳球菌生理功能,扩展应用范围,强化其益生性能具有重要意义.以乳酸乳球菌噬菌体(Bacteriophage r1t)为材料,通过PCR分别克隆了其穿孔素(holin)及裂解素(lysin)基因lytH和lytA,构建了重组质粒pNZ8148-lytH、pNZ8148-lytA和pNZ8148-lytHA;通过电击转化法将重组质粒导入Lactococcus lactis NZ9000,构建了重组菌株NZ9000(pNZ8148-lytH)、NZ9000(pNZ8148-lytA)和NZ9000(pNZ8148-lytHA).菌株裂解活性研究结果表明,重组菌株NZ9000(pNZ8148-lytH)及NZ9000(pNZ8148-lytHA)均展现出较好的裂解活性,远高于对照菌株NZ9000(pNZ8148)及重组工程菌株NZ9000(pNZ8148-lytA).且重组菌株NZ9000(pNZ8148-lytHA)的裂解活性为最高,经2 ng/L nisin诱导后,其菌液浊度急剧下降,2 h内,OD600可从0.75降至0.09,并释放大量胞内蛋白至培养液中.这为进一步构建食品级可控性乳酸菌裂解系统并提升乳酪生产过程中发酵剂的裂解效率及水平奠定了实验基础.为进一步提升乳酸乳球菌发酵乳制品的益生性能,在上述可控性裂解系统基础上,选取能够在发酵过程中同时生产具有降低血压、镇定安神、调节激素分泌、健肝利肾等多项生理功能的非蛋白质氨基酸γ-氨基丁酸(GABA)为目标,并进行了初步探索.在克隆获取了短乳杆菌CGMCC1306染色体上的谷氨酸脱羧酶基因(gadB)基础上,将该基因构建至乳酸菌组成型表达载体pMG36e中;再克隆获取包含P32启动子的gadB片段,并构建至载体pNZ8148-lytHA中,获得重组质粒pNZ8148-lytHAP32-gadB;此后将克隆获取的基因片段"lytHA-P32-gadB",构建至食品级表达载体pNZ8149中,通过电击转化入L.lactis NZ3900,构建出食品级重组菌株NZ3900(pNZ8149-lytHA-P32-gadB).重组菌株30℃条件下于含有30 g/L底物L-谷氨酸钠的MRS培养基中静置发酵16 h,发酵液中GABA含量达6.77 g/L,为对照菌株NZ3900(pNZ8149)的6.5倍;而当重组菌株OD600生长至约1.0时加入nisin后,细胞迅速裂解,生物量急剧下降,但16 h时发酵液中GABA含量则进一步提升至12.39g/L,展现出更好的应用价值.这为进一步利用该系统生产优质的功能性乳制品奠定了实验基础.
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