【摘 要】
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混合模式层析(Mixed-mode Chromato-graphy,MMC)是一种新型的生物分离方法,有效组合多种相互作用,提高蛋白结合的选择性,并利用静电排斥作用实现洗脱,已在抗体等蛋白的分离纯化中得到应用.MMC具有耐盐吸附特性,可以在较宽离子强度范围内有效吸附目标蛋白,避免对料液的预处理,提高分离效率.在前期研究基础上,本文以色胺为新型MMC配基,制备混合模式层析介质,以人血白蛋白(HAS)
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混合模式层析(Mixed-mode Chromato-graphy,MMC)是一种新型的生物分离方法,有效组合多种相互作用,提高蛋白结合的选择性,并利用静电排斥作用实现洗脱,已在抗体等蛋白的分离纯化中得到应用.MMC具有耐盐吸附特性,可以在较宽离子强度范围内有效吸附目标蛋白,避免对料液的预处理,提高分离效率.在前期研究基础上,本文以色胺为新型MMC配基,制备混合模式层析介质,以人血白蛋白(HAS)为分离对象,考察pH和添加盐等对蛋白吸附的影响,实现酵母发酵液中分离重组人血白蛋白(rHSA).首先,优化了介质制备过程,考察了反应pH和配基添加量的影响,发现配基密度随反应pH升高而增大;采用3倍双键密度的配基添加量,配基密度达最高;制备了高配基密度的MMC介质,配基密度达到150 μmol/g.其次,考察了不同pH和盐浓度对HAS吸附的影响,结果表明pH对HAS吸附影响较大,pH5时饱和吸附容量(Qm)最高,达到141.3 mg/g;pH4时,吸附容量显著下降;pH大于5时,随pH增大吸附容量逐步下降.比较了NaCl和(NH4)2SO4两种盐添加的影响,发现略有不同,但均体现出一定的耐盐吸附特性.添加NaCl时,Qm随盐浓度升高逐渐下降,当浓度达1.0 M 时吸附量为70.5mg/g;添加(NH4)2SO4时,随盐浓度升高,Qm呈先下降后升高的趋势.最后,将色胺为配基的新型MMC介质用于分离毕赤酵母发酵液表达的rHSA,发现pH影响与HAS类似,料液稀释对rHSA吸附量影响较小,优化了分离条件,设计了两步阶跃洗脱的分离模式,pH7.0洗脱去除小分子杂质(如色素),pH4.0洗脱得到rHSA,电泳分析纯度达到87.0％,收率90.8％.结果表明,以色胺为配基的新型MMC介质具有良好的HAS分离能力,具有较高的吸附容量,较好的耐盐吸附特性,发酵液无需稀释和pH调节等预处理,即可直接层析分离,分离效率高,体现出良好的应用前景.
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