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[摘要] 目的 探讨苦参碱及苦参碱联合顺铂对小鼠移植性宫颈癌的抑制作用，分析苦参碱是否能减少顺铂的副作用。 方法 建立U14荷瘤小鼠模型，随机分成8组（每组10只）：阴性对照组，顺铂组，苦参碱高、中、低剂量组，顺铂联合苦参碱高、中、低剂量组。以抑瘤率为指标，观察各组药物对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用；以小鼠的一般状况及血清肌酐、尿素氮为指标，观察联合用药是否能减少顺铂治疗的副作用。结果 苦参碱高、中剂量组和联合用药各组对U14实体瘤均有不同程度的抑制作用，抑瘤率均＞30%且苦参碱高剂量组和联合用药各组瘤重较阴性对照组显著减少（P＜0.01），苦参碱中剂量组瘤重较对照减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。联合用药各组荷瘤小鼠一般情况较顺铂组好，联合高、中剂量组肌酐、尿素氮水平较顺铂組低（P＜0.05）。 结论 苦参碱具有抗肿瘤作用，与顺铂联合使用，在增加抑瘤作用的同时，可适度减少顺铂的副作用。
[关键词] 苦参碱；顺铂；U14荷瘤小鼠；联合用药；抗肿瘤作用
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）07-34-03
苦参是豆科植物苦参的干燥根，为临床常用的中药之一。苦参碱类生物碱是从苦参中提取的具有广泛药理作用的活性物质[1]。近年研究发现，苦参碱有抗肿瘤的作用，能抑制很多肿瘤中的细胞增殖，导致其肿瘤细胞凋亡。顺铂是当前治疗肿瘤最常用的药物之一，其具有抗癌谱广、作用强，与多种抗肿瘤药物有协同作用、无交叉耐药等特点。但顺铂具有肾毒性、骨髓抑制、胃肠道反应等副作用，在缓解患者病情的同时也为他们带来很多的不良反应，降低了患者的生活质量。本实验采用建立U14荷瘤小鼠模型结合药理学分析的方法，选择肿瘤抑瘤率以及肝肾功中具有代表性的肌酐、尿素氮水平为指标，初步研究苦参碱、顺铂及两者联合用药对宫颈癌的抑制作用，并分析苦参碱是否能降低顺铂治疗宫颈癌的副作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物清洁级雌性昆明种小鼠80只，体重（20±2）g，6~8周龄，购于兰州大学基础医学院实验动物中心，动物合格证为SCXK（甘）：2009-0004。
1.1.2 瘤细胞株 小鼠宫颈癌细胞株（U14），购于中国医学科学院基础医学研究所。
1.1.3 药物 注射用苦参碱（商品名：瑞琳利尔，国药集团国瑞药业有限公司，H20030719，50 mg/支）；注射用顺铂冻干型（齐鲁制药有限公司，H20023460，10 mg/支）。
1.2 实验方法
1.2.1 瘤细胞培养 U14接种入含10%胎牛血清，双抗100 U/mL的DMEM高糖培养基培养，待细胞生长至80%左右时，0.125%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期U14细胞，提前在雌性昆明小鼠腹腔内定期传代，制种鼠备用。
1.2.2 U14荷瘤小鼠模型的制备 将小鼠逐只称重记录并随机分为8组，每组10只。8组分别为苦参碱高、中、低3 个剂量组，顺铂联合苦参碱高、中、低3个剂量组，阴性对照组和顺铂组。在无菌条件下，取预先在种鼠体内传代三次（每次7~9 d）的U14细胞（腹水），0.2%台盼蓝染色计数活细胞率，活细胞率大于95%时，用无菌生理盐水稀释，调整细胞浓度到5×106 mL[2]，制成瘤细胞悬液。在每只小鼠右前肢腋下注射0.2 mL瘤细胞悬液，制作局灶性肿瘤模型，成瘤率为100%[3]。
1.2.3 给药 接种第3天开始给药。阴性对照组予注射用水；顺铂组予顺铂2 mg/（kg·d）[4]；苦参碱高、中、低剂量组分别按75、50、35 mg/（kg·d）[5]剂量给药；顺铂联合苦参碱高、中、低剂量组在各组剂量的基础上联合顺铂2 mg/（kg·d），上述药物浓度的给药剂量均为0.2 mL，瘤体周围局部注射，连续用药10 d。期间常规饲养，每日观察荷瘤小鼠活动、进食及瘤体变化情况。
1.2.4 平均瘤重及抑瘤率测定 第11天对荷瘤小鼠行脱臼处死，处死前称重，计算小鼠体重均值；剥取移植瘤称瘤重，计算瘤重抑瘤率：抑瘤率=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。
1.2.5 肌酐、尿素氮水平测定 处死荷瘤小鼠时摘取眼球采血，室温静置1~2 h左右后，8 000 r/min，5 min离心取血清。使用LX-20全自动生化分析仪（美国BECKMAN-COULTER公司生产）分别测定尿素氨、肌酐水平变化（尿素氮检测试剂为北京柏定生物工程有限公司试剂盒，肌酐检测试剂为烟台澳斯邦生物工程有限公司试剂盒）。
1.3 统计学处理
所有数据以（）表示，利用SPSS17.0统计软件进行数据处理，对计量资料采用单因素方差分析，LSD法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 苦参碱与苦参碱联合顺铂对U14荷瘤小鼠抑制作用的影响
苦参碱各剂量组和联合用药各组的瘤重均较阴性对照组减少，顺铂组、苦参碱高剂量组和联合用药各组瘤重显著减少（P＜0.01），苦参碱中剂量组瘤重较对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。顺铂联合苦参碱高剂量组抑瘤率达到58.33%，略高于单用顺铂组的抑瘤率57.29%；各联合用药组抑瘤率（58.33%、49.14%、41.43%）均高于单用苦参碱组（38.60%、33.04%、15.47%），说明苦参碱高、中剂量组和联合用药各组对U14实体瘤均有不同程度的抑制作用，而联合用药效果好于单用苦参碱。苦参碱低剂量组抑瘤作用不明显。见表1。
2.2 苦参碱联合顺铂对U14荷瘤小鼠肌酐、尿素氮水平的影响
实验过程中观察荷瘤小鼠，阴性对照组活动逐渐减少，后期食欲明显下降，消瘦但瘤体大，毛色晦暗干枯，精神萎靡，喜卧不喜动，实验结束1只死亡。顺铂组治疗前期呈现倦怠，上述表现也较为明显，治疗中期上述情况有所好转，但后期约半数出现反常性躁动，体重下降高于其余各组，食欲差，摄水少，排尿、便少，应与顺铂治疗的副作用有关。联合用药各组小鼠一般情况好于上述两组，尤食欲下降不明显，活动较上述两组多，二便基本正常，联合高剂量组肌酐、尿素氮水平与顺铂组相比显著降低（P＜0.01），联合中剂量组较顺铂组减少，差异有统计学意义（P＜0.05），低剂量组下降不明显，说明联合一定浓度苦参碱用药可适当减少顺铂的不良反应。见表2。
3 讨论
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在我国的发病率高居世界第2位，居妇科恶性肿瘤死亡的第1位，是危害我国妇女健康的主要恶性肿瘤[6]。传统的宫颈癌治疗手段主要依靠手术治疗和放射治疗，对早期宫颈癌可取得较好的疗效，但对于中晚期宫颈癌的疗效并不理想[7]。近些年来随着抗癌药物的不断问世，晚期病例多采用多药联合治疗、不同途径给药等化学治疗方法，以期患者生存期有所延长，但同时，手术的创伤，化疗、放疗的副作用也在一定程度上影响着患者的生活质量。目前利用或联合传统中药治疗肿瘤已成为一个新途径，而有关苦参碱类抗肿瘤作用的研究也成为抗癌中药研究的一个热点。有药理和临床试验证实，苦参碱对多种肿瘤细胞具有抑制作用，其抗肿瘤作用全面广泛，而对机体正常细胞几乎不产生破坏作用，甚至有升高白细胞的作用[8]。本实验以U14荷瘤小鼠为动物模型，首先观察了苦参碱、苦参碱联合顺铂对U14实体瘤的抑瘤作用，实验结果显示，苦参碱高剂量组、联合用药各组和顺铂组瘤重明显低于阴性对照组瘤重，差异有统计学意义（P＜0.01）；苦参碱中剂量组瘤重低于阴性对照组瘤重，差异有统计学意义（P＜0.05）。苦参碱高、中剂量组，联合用药各组及顺铂组的抑瘤率分别为38.60%、33.04%、58.33%、49.14%、41.43%、57.29%，抑瘤率均＞30%，符合《现代肿瘤治疗药物学》关于抗肿瘤中药有效性的标准，即抑瘤率＞30%[9]，可判断为阳性，以此为标准，说明高、中剂量苦参碱具有一定抗肿瘤作用，且联合顺铂应用效果要好于单用苦参碱。而对于苦参碱低剂量组，虽然瘤重与阴性对照组相比减少，但差异无统计学意义（P＞0.05），且其抑瘤率仅为15.47%，未超过30%，故无明显抑制肿瘤生长的作用。其次，实验中可以观察到，顺铂组荷瘤小鼠给药过程中逐渐出现反常性躁动，食欲差，摄水少，排尿、便少，体重下降等与顺铂治疗的副作用有关的表现，而联合用药各组小鼠一般情况要好于顺铂组，上述表现出现较少，测联合用药各组肌酐、尿素氮水平与顺铂组相比较低，差异有统计学意义（P＜0.05），说明联合苦参碱用药可适当减少顺铂治疗产生的副作用。有实验表明，苦参碱联合顺铂对H22荷瘤小鼠肿瘤生长有明显抑制作用[10]，一定程度上提高肿瘤患者生存质量，均与本实验结果相似。
总之，通过该实验，证实了一定浓度的苦参碱对实体瘤U14小鼠具有抗肿瘤作用，与顺铂联合应用可以增加顺铂的抗肿瘤效应，减轻副作用，提高肿瘤患者的生活质量，这为抗肿瘤新药的开发和临床肿瘤治疗的新思路提供了一定实验依据，具有积极的意义。
[参考文献]
[1] 梁生旺，刘伟.中药制剂定量分析[M].北京：中国中医药出版社，1997：180-182.
[2] 刘娟，李影，赵旭伟.北豆根中生物碱对U14荷瘤鼠的抑制作用[J].职业与健康，2010，26（11）：1228-1229.
[3] 顾蓓，冯海凉，刘玉琴，等.小鼠子宫颈癌U14细胞系的建立及生物学特性研究[J].中国肿瘤临床杂志，2008，35（7）：391-394.
[4] van Moorsel CJ，Pinedo HM，Veerman G，et al.Scheduling of gemcitabine and cisplatin in Lewis lung tumour bearing mice[J].Eur J Cancer，1999，8（3）：208-214.
[5] Wang XY，Liang L，Chang JL，et al.Toxicity of Matrine in Kunming mice[J].Journal of Southern Medical University，2010，9：2154-2155.
[6] 曾红，贾木英，刘红俊，等.妇科恶性肿瘤发病情况及高危因素分析[J].中国妇幼保健，2006，21（17）：2416-2419.
[7] Grigsby PW，Herzog TJ.Current management of patients with invasive cervical carcinoma[J].Clin Obstet Gynecol，2001，44（3）：531-537.
[8] Ruan J，Liu J，Zhu D，et al.Preparation and evaluation of self-nanoemulsified drug delivery systems （SNEDDSs） of Matrine based on drug-phospholipid complex technique[J].Int J Pharm，2010，386（1-2）：282-290.
[9] 陳小毅，孙宁.全国第四界免疫缺陷试验研究学术交流会纪要[J].实验动物学，1993，10（1）：45-47.
[10] 黄宏思，黄赞松，黄卫彤，等.苦参碱与顺铂合用对小鼠肝癌移植瘤的影响[J].时珍国医国药，2008，19（9）：2102-2103．
（收稿日期：2012-03-09）
[关键词] 苦参碱；顺铂；U14荷瘤小鼠；联合用药；抗肿瘤作用
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）07-34-03
苦参是豆科植物苦参的干燥根，为临床常用的中药之一。苦参碱类生物碱是从苦参中提取的具有广泛药理作用的活性物质[1]。近年研究发现，苦参碱有抗肿瘤的作用，能抑制很多肿瘤中的细胞增殖，导致其肿瘤细胞凋亡。顺铂是当前治疗肿瘤最常用的药物之一，其具有抗癌谱广、作用强，与多种抗肿瘤药物有协同作用、无交叉耐药等特点。但顺铂具有肾毒性、骨髓抑制、胃肠道反应等副作用，在缓解患者病情的同时也为他们带来很多的不良反应，降低了患者的生活质量。本实验采用建立U14荷瘤小鼠模型结合药理学分析的方法，选择肿瘤抑瘤率以及肝肾功中具有代表性的肌酐、尿素氮水平为指标，初步研究苦参碱、顺铂及两者联合用药对宫颈癌的抑制作用，并分析苦参碱是否能降低顺铂治疗宫颈癌的副作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物清洁级雌性昆明种小鼠80只，体重（20±2）g，6~8周龄，购于兰州大学基础医学院实验动物中心，动物合格证为SCXK（甘）：2009-0004。
1.1.2 瘤细胞株 小鼠宫颈癌细胞株（U14），购于中国医学科学院基础医学研究所。
1.1.3 药物 注射用苦参碱（商品名：瑞琳利尔，国药集团国瑞药业有限公司，H20030719，50 mg/支）；注射用顺铂冻干型（齐鲁制药有限公司，H20023460，10 mg/支）。
1.2 实验方法
1.2.1 瘤细胞培养 U14接种入含10%胎牛血清，双抗100 U/mL的DMEM高糖培养基培养，待细胞生长至80%左右时，0.125%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期U14细胞，提前在雌性昆明小鼠腹腔内定期传代，制种鼠备用。
1.2.2 U14荷瘤小鼠模型的制备 将小鼠逐只称重记录并随机分为8组，每组10只。8组分别为苦参碱高、中、低3 个剂量组，顺铂联合苦参碱高、中、低3个剂量组，阴性对照组和顺铂组。在无菌条件下，取预先在种鼠体内传代三次（每次7~9 d）的U14细胞（腹水），0.2%台盼蓝染色计数活细胞率，活细胞率大于95%时，用无菌生理盐水稀释，调整细胞浓度到5×106 mL[2]，制成瘤细胞悬液。在每只小鼠右前肢腋下注射0.2 mL瘤细胞悬液，制作局灶性肿瘤模型，成瘤率为100%[3]。
1.2.3 给药 接种第3天开始给药。阴性对照组予注射用水；顺铂组予顺铂2 mg/（kg·d）[4]；苦参碱高、中、低剂量组分别按75、50、35 mg/（kg·d）[5]剂量给药；顺铂联合苦参碱高、中、低剂量组在各组剂量的基础上联合顺铂2 mg/（kg·d），上述药物浓度的给药剂量均为0.2 mL，瘤体周围局部注射，连续用药10 d。期间常规饲养，每日观察荷瘤小鼠活动、进食及瘤体变化情况。
1.2.4 平均瘤重及抑瘤率测定 第11天对荷瘤小鼠行脱臼处死，处死前称重，计算小鼠体重均值；剥取移植瘤称瘤重，计算瘤重抑瘤率：抑瘤率=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。
1.2.5 肌酐、尿素氮水平测定 处死荷瘤小鼠时摘取眼球采血，室温静置1~2 h左右后，8 000 r/min，5 min离心取血清。使用LX-20全自动生化分析仪（美国BECKMAN-COULTER公司生产）分别测定尿素氨、肌酐水平变化（尿素氮检测试剂为北京柏定生物工程有限公司试剂盒，肌酐检测试剂为烟台澳斯邦生物工程有限公司试剂盒）。
1.3 统计学处理
所有数据以（）表示，利用SPSS17.0统计软件进行数据处理，对计量资料采用单因素方差分析，LSD法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 苦参碱与苦参碱联合顺铂对U14荷瘤小鼠抑制作用的影响
苦参碱各剂量组和联合用药各组的瘤重均较阴性对照组减少，顺铂组、苦参碱高剂量组和联合用药各组瘤重显著减少（P＜0.01），苦参碱中剂量组瘤重较对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。顺铂联合苦参碱高剂量组抑瘤率达到58.33%，略高于单用顺铂组的抑瘤率57.29%；各联合用药组抑瘤率（58.33%、49.14%、41.43%）均高于单用苦参碱组（38.60%、33.04%、15.47%），说明苦参碱高、中剂量组和联合用药各组对U14实体瘤均有不同程度的抑制作用，而联合用药效果好于单用苦参碱。苦参碱低剂量组抑瘤作用不明显。见表1。
2.2 苦参碱联合顺铂对U14荷瘤小鼠肌酐、尿素氮水平的影响
实验过程中观察荷瘤小鼠，阴性对照组活动逐渐减少，后期食欲明显下降，消瘦但瘤体大，毛色晦暗干枯，精神萎靡，喜卧不喜动，实验结束1只死亡。顺铂组治疗前期呈现倦怠，上述表现也较为明显，治疗中期上述情况有所好转，但后期约半数出现反常性躁动，体重下降高于其余各组，食欲差，摄水少，排尿、便少，应与顺铂治疗的副作用有关。联合用药各组小鼠一般情况好于上述两组，尤食欲下降不明显，活动较上述两组多，二便基本正常，联合高剂量组肌酐、尿素氮水平与顺铂组相比显著降低（P＜0.01），联合中剂量组较顺铂组减少，差异有统计学意义（P＜0.05），低剂量组下降不明显，说明联合一定浓度苦参碱用药可适当减少顺铂的不良反应。见表2。
3 讨论
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在我国的发病率高居世界第2位，居妇科恶性肿瘤死亡的第1位，是危害我国妇女健康的主要恶性肿瘤[6]。传统的宫颈癌治疗手段主要依靠手术治疗和放射治疗，对早期宫颈癌可取得较好的疗效，但对于中晚期宫颈癌的疗效并不理想[7]。近些年来随着抗癌药物的不断问世，晚期病例多采用多药联合治疗、不同途径给药等化学治疗方法，以期患者生存期有所延长，但同时，手术的创伤，化疗、放疗的副作用也在一定程度上影响着患者的生活质量。目前利用或联合传统中药治疗肿瘤已成为一个新途径，而有关苦参碱类抗肿瘤作用的研究也成为抗癌中药研究的一个热点。有药理和临床试验证实，苦参碱对多种肿瘤细胞具有抑制作用，其抗肿瘤作用全面广泛，而对机体正常细胞几乎不产生破坏作用，甚至有升高白细胞的作用[8]。本实验以U14荷瘤小鼠为动物模型，首先观察了苦参碱、苦参碱联合顺铂对U14实体瘤的抑瘤作用，实验结果显示，苦参碱高剂量组、联合用药各组和顺铂组瘤重明显低于阴性对照组瘤重，差异有统计学意义（P＜0.01）；苦参碱中剂量组瘤重低于阴性对照组瘤重，差异有统计学意义（P＜0.05）。苦参碱高、中剂量组，联合用药各组及顺铂组的抑瘤率分别为38.60%、33.04%、58.33%、49.14%、41.43%、57.29%，抑瘤率均＞30%，符合《现代肿瘤治疗药物学》关于抗肿瘤中药有效性的标准，即抑瘤率＞30%[9]，可判断为阳性，以此为标准，说明高、中剂量苦参碱具有一定抗肿瘤作用，且联合顺铂应用效果要好于单用苦参碱。而对于苦参碱低剂量组，虽然瘤重与阴性对照组相比减少，但差异无统计学意义（P＞0.05），且其抑瘤率仅为15.47%，未超过30%，故无明显抑制肿瘤生长的作用。其次，实验中可以观察到，顺铂组荷瘤小鼠给药过程中逐渐出现反常性躁动，食欲差，摄水少，排尿、便少，体重下降等与顺铂治疗的副作用有关的表现，而联合用药各组小鼠一般情况要好于顺铂组，上述表现出现较少，测联合用药各组肌酐、尿素氮水平与顺铂组相比较低，差异有统计学意义（P＜0.05），说明联合苦参碱用药可适当减少顺铂治疗产生的副作用。有实验表明，苦参碱联合顺铂对H22荷瘤小鼠肿瘤生长有明显抑制作用[10]，一定程度上提高肿瘤患者生存质量，均与本实验结果相似。
总之，通过该实验，证实了一定浓度的苦参碱对实体瘤U14小鼠具有抗肿瘤作用，与顺铂联合应用可以增加顺铂的抗肿瘤效应，减轻副作用，提高肿瘤患者的生活质量，这为抗肿瘤新药的开发和临床肿瘤治疗的新思路提供了一定实验依据，具有积极的意义。
[参考文献]
[1] 梁生旺，刘伟.中药制剂定量分析[M].北京：中国中医药出版社，1997：180-182.
[2] 刘娟，李影，赵旭伟.北豆根中生物碱对U14荷瘤鼠的抑制作用[J].职业与健康，2010，26（11）：1228-1229.
[3] 顾蓓，冯海凉，刘玉琴，等.小鼠子宫颈癌U14细胞系的建立及生物学特性研究[J].中国肿瘤临床杂志，2008，35（7）：391-394.
[4] van Moorsel CJ，Pinedo HM，Veerman G，et al.Scheduling of gemcitabine and cisplatin in Lewis lung tumour bearing mice[J].Eur J Cancer，1999，8（3）：208-214.
[5] Wang XY，Liang L，Chang JL，et al.Toxicity of Matrine in Kunming mice[J].Journal of Southern Medical University，2010，9：2154-2155.
[6] 曾红，贾木英，刘红俊，等.妇科恶性肿瘤发病情况及高危因素分析[J].中国妇幼保健，2006，21（17）：2416-2419.
[7] Grigsby PW，Herzog TJ.Current management of patients with invasive cervical carcinoma[J].Clin Obstet Gynecol，2001，44（3）：531-537.
[8] Ruan J，Liu J，Zhu D，et al.Preparation and evaluation of self-nanoemulsified drug delivery systems （SNEDDSs） of Matrine based on drug-phospholipid complex technique[J].Int J Pharm，2010，386（1-2）：282-290.
[9] 陳小毅，孙宁.全国第四界免疫缺陷试验研究学术交流会纪要[J].实验动物学，1993，10（1）：45-47.
[10] 黄宏思，黄赞松，黄卫彤，等.苦参碱与顺铂合用对小鼠肝癌移植瘤的影响[J].时珍国医国药，2008，19（9）：2102-2103．
（收稿日期：2012-03-09）