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摘 要：建立了安化黑砖茶中化学成分的超高效液相色谱-电喷雾串联飞行时间质谱（HPLC-ESI-Q/TOF-MS）快速分离和筛查的方法。实验用65%乙醇在80℃水浴恒温条件下提取安化黑砖茶样品，采用LC-ESI-Q/TOF-MS仪对其进行分离并检测。利用UNIFI软件中精确质量数筛查功能模块，结合保留时间、多级质谱、特征碎片离子等信息，对安化黑砖茶中的化学成分进行了初步确证。该法可得到安化黑砖茶特征成分的信息，可为安化砖茶的品质评价和质量控制提供一种新的技术手段。
关键词：液相色谱-电喷雾串联飞行时间质谱;安化黑砖茶;化学成分
Research on Chemical Analysis of Anhua Black Brick Tea Based on UNIFI
Tang Min，Luo Weimei，Zeng Minghui
（Yiyang medical college，Yiyang 413002）
Abstract：A method for the rapid separation and screening of chemical constituents in Anhua black brick tea by ultra performance liquid chromatography-electrospray tandem time of flight mass spectrometry（HPLC-ESI-Q/TOF-MS）was established.In the experiment，65% ethanol was used to extract Anhua black brick tea samples under the constant temperature of 80 ℃ water bath，and the samples were separated and detected by LC-ESI-Q/TOF-MS.Using the accurate mass screening function module in UNIFI software，combined with information such as retention time，multi-stage mass spectrometry，and characteristic fragment ions，the chemical composition of Anhua black brick tea was preliminarily confirmed.This method can obtain the information of the characteristic components of Anhua black brick tea，and can provide a new technical means for the quality evaluation and quality control of Anhua brick tea.
Key words：HPLC-ESI-Q/TOF-MS;Anhua black brick tea;chemical constitution
1.前言
具有国家地理标志的安化黑茶，因其独特品质和保健功能逐渐被消费者所认同1。随着大健康产业的发展，安化黑茶已成为国内外茶叶市场的新贵。安化黑茶是六大基本茶类之一，市售的安化黑茶主要品种有“三尖”、“三砖”、“一卷”2-3。其中“三砖”指茯砖、黑砖和花砖，均以安化黑毛茶为原料，但制作工艺有所区别。目前，安化砖茶鉴别方法主要为感官评定和简单理化指标检测方法，其中感官评定结果主观性强，不确定因素较多4。常规理化指标检测方法无法全面反映茶叶的整体特征，难以进行正确识别。随着高通量、高灵敏度、高分辨率的仪器分析技术的发展，液质联用技术为获得茶叶的全组分信息提供了可能5。基于Waters公司的UNIFI软件的精确分子量匹配的筛查功能可实现对复杂化学成分的鉴定6，可为安化黑茶的鉴别提供技术手段，以及为其质量标准的建立提供科学依据。
2.实验部分
2.1 主要仪器与试剂
2.1.1 仪器：Waters Acquity超高效液相系统，Waters-Xevo-G2-QTOF质谱系统。Mettler MS205DU型电子分析天平;KQ5200型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。
2.1.2 试剂：亮氨酸脑啡肽购自Waters公司;甲酸、乙腈均为色谱纯（购于Merck公司）;纯净水为ELGA超纯水;湖南安化黑砖茶，市售。
2.2 仪器工作條件
2.2.1 液相色谱条件
色谱柱为ACQUITY UPLC-BEHC18（2.1mm×100mm，1.7μm）;流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，进行梯度洗脱（0～10 min，5% B→20% B;10～19min，20%B→50%B;19～20 min，50%B→99% B）;流速为0.3mL/min;柱温为40℃;进样量为1μL。
2.2.2 质谱条件
离子化模式为ESI+，毛细管电压为3kV，锥孔电压为40V，除溶剂温度为400℃，除溶剂气体为800L/h，离子源温度为120℃。采用MSE方式进行数据采集，采集时间为50min，扫描范围为100～1500amu，扫描时间为0.2 s。碰撞能量：低能量为6V，梯度高能量为20～30V。
2.3 数据处理
经Waters masslynx4.1软件采集的raw数据，经UNIFI软件转化成uep格式文件，采用精确分子量筛查模式建立分析方法，质量范围100-1500Da及误差数10mDa，保留时间0-50min及误差数为0.2sec。 2.4 茶汤样品制备
取市售安化黑砖茶2.00g，置于100m L的圆形烧瓶中，按料液比1：15加65%的乙醇在80℃左右浸提三次，浸提时间为60min，趁热抽滤，合并三次滤液，将滤液转移至100ml容量瓶中，用65%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置。配制好的茶汤过0.22μm的微孔滤膜后待用。
3.结果与讨论
在2.2仪器条件下，对安化黑茶砖样品提取液进行分析，图1为样品溶液的LC-ESI-Q/TOF-MS总离子流图（TIC）。所得的高分辨质谱raw数据，经过UNIFI精确分子质量筛查模块处理后，共计快速筛查出12种化学成分（见图2A），相关信息见表1。
UNIFI软件对化合物的鉴定非常强大，以安化黑茶砖样品提取液中响应最大的咖啡碱为例，其提取离子峰如图2B，咖啡碱的高能量质谱图和低能量质谱图分别见图3A和3B。最终鉴别出12种化学成分，分别是茶氨酸、没食子酸、可可碱、没食子酚儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素-没食子酸酯、山柰酚-3-O-芸香糖苷、儿茶素-3-O-没食子酸酯、槲皮素-3-O-芸香糖苷、山柰酚和槲皮素。
4.结论
黑茶因具有茶多酚、茶色素、茶多糖等功能性成分7，具有明显减肥、助消化、抗氧化、抗菌等功能8。本研究利用超高效液相色谱-电喷雾串联飞行时间质谱对安化黑砖茶进行分析，并基于UNIFI软件精确分子量筛查功能对黑砖茶样品溶液中的所含化学成分进行鉴定，共计筛查出12个化合物，该方法快速准确，可为安化黑茶的鉴定提供及手段，同时为其质量标准的建立提供科学依据。
参考文献
[1]黄皓，翁昆.我国地理标志产品和茶叶产品保护的现状[J].中国茶叶加工，2010（1）：8-11.
[2]萧力争，郭则之，谭振初.湖南黑茶花色品种的发生与发展史略[J].中国茶叶加工，2007（4）：50-52.
[3]孟涛，邹勋.安化黑茶产业现状与发展策略[J].茶叶通讯，2011，38（1）：17-20.
[4]钟新菊，谢恒铨.茶叶审评的内容与应注意的若干问题[J].福建茶叶，2011，33（2）：31-32.
[5]颜鸿飞，王美玲，邹灿， et al. LC-IT-TOF MS法分析湖南黑茶中水溶性成分[J].化学分析计量，2017（3）：22-26.
[6]L.Deng，A.M.Shi，H.Z.Liu，N.Meruva，L.Liu，H.Hu，Y.Yang，C.Huang，P.Li and Q.Wang，"Identification of chemical ingredients of peanut stems and leaves extracts using uplc-qtof-ms coupled with novel informatics unifi platform"，Journal of mass spectrometry，Vol.51，no.12，pp.1157-1167，2016.
[7]黃业伟，杨晓颖，向泽敏，et al.黑茶化学成分分析研究进展[J].食品界，2019（2）：79-80.
[8]何煜波，姜爱丽，胡文忠，et al.黑茶加工工艺与保健功能研究[J].安徽农业科学，2012（27）：13595-13597.
作者简介：
唐敏（1984-），男，博士，讲师，从事中药作用物质基础及作用机理研究。
基金项目：湖南省教育厅科研项目（15C1379）
关键词：液相色谱-电喷雾串联飞行时间质谱;安化黑砖茶;化学成分
Research on Chemical Analysis of Anhua Black Brick Tea Based on UNIFI
Tang Min，Luo Weimei，Zeng Minghui
（Yiyang medical college，Yiyang 413002）
Abstract：A method for the rapid separation and screening of chemical constituents in Anhua black brick tea by ultra performance liquid chromatography-electrospray tandem time of flight mass spectrometry（HPLC-ESI-Q/TOF-MS）was established.In the experiment，65% ethanol was used to extract Anhua black brick tea samples under the constant temperature of 80 ℃ water bath，and the samples were separated and detected by LC-ESI-Q/TOF-MS.Using the accurate mass screening function module in UNIFI software，combined with information such as retention time，multi-stage mass spectrometry，and characteristic fragment ions，the chemical composition of Anhua black brick tea was preliminarily confirmed.This method can obtain the information of the characteristic components of Anhua black brick tea，and can provide a new technical means for the quality evaluation and quality control of Anhua brick tea.
Key words：HPLC-ESI-Q/TOF-MS;Anhua black brick tea;chemical constitution
1.前言
具有国家地理标志的安化黑茶，因其独特品质和保健功能逐渐被消费者所认同1。随着大健康产业的发展，安化黑茶已成为国内外茶叶市场的新贵。安化黑茶是六大基本茶类之一，市售的安化黑茶主要品种有“三尖”、“三砖”、“一卷”2-3。其中“三砖”指茯砖、黑砖和花砖，均以安化黑毛茶为原料，但制作工艺有所区别。目前，安化砖茶鉴别方法主要为感官评定和简单理化指标检测方法，其中感官评定结果主观性强，不确定因素较多4。常规理化指标检测方法无法全面反映茶叶的整体特征，难以进行正确识别。随着高通量、高灵敏度、高分辨率的仪器分析技术的发展，液质联用技术为获得茶叶的全组分信息提供了可能5。基于Waters公司的UNIFI软件的精确分子量匹配的筛查功能可实现对复杂化学成分的鉴定6，可为安化黑茶的鉴别提供技术手段，以及为其质量标准的建立提供科学依据。
2.实验部分
2.1 主要仪器与试剂
2.1.1 仪器：Waters Acquity超高效液相系统，Waters-Xevo-G2-QTOF质谱系统。Mettler MS205DU型电子分析天平;KQ5200型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。
2.1.2 试剂：亮氨酸脑啡肽购自Waters公司;甲酸、乙腈均为色谱纯（购于Merck公司）;纯净水为ELGA超纯水;湖南安化黑砖茶，市售。
2.2 仪器工作條件
2.2.1 液相色谱条件
色谱柱为ACQUITY UPLC-BEHC18（2.1mm×100mm，1.7μm）;流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，进行梯度洗脱（0～10 min，5% B→20% B;10～19min，20%B→50%B;19～20 min，50%B→99% B）;流速为0.3mL/min;柱温为40℃;进样量为1μL。
2.2.2 质谱条件
离子化模式为ESI+，毛细管电压为3kV，锥孔电压为40V，除溶剂温度为400℃，除溶剂气体为800L/h，离子源温度为120℃。采用MSE方式进行数据采集，采集时间为50min，扫描范围为100～1500amu，扫描时间为0.2 s。碰撞能量：低能量为6V，梯度高能量为20～30V。
2.3 数据处理
经Waters masslynx4.1软件采集的raw数据，经UNIFI软件转化成uep格式文件，采用精确分子量筛查模式建立分析方法，质量范围100-1500Da及误差数10mDa，保留时间0-50min及误差数为0.2sec。 2.4 茶汤样品制备
取市售安化黑砖茶2.00g，置于100m L的圆形烧瓶中，按料液比1：15加65%的乙醇在80℃左右浸提三次，浸提时间为60min，趁热抽滤，合并三次滤液，将滤液转移至100ml容量瓶中，用65%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置。配制好的茶汤过0.22μm的微孔滤膜后待用。
3.结果与讨论
在2.2仪器条件下，对安化黑茶砖样品提取液进行分析，图1为样品溶液的LC-ESI-Q/TOF-MS总离子流图（TIC）。所得的高分辨质谱raw数据，经过UNIFI精确分子质量筛查模块处理后，共计快速筛查出12种化学成分（见图2A），相关信息见表1。
UNIFI软件对化合物的鉴定非常强大，以安化黑茶砖样品提取液中响应最大的咖啡碱为例，其提取离子峰如图2B，咖啡碱的高能量质谱图和低能量质谱图分别见图3A和3B。最终鉴别出12种化学成分，分别是茶氨酸、没食子酸、可可碱、没食子酚儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素-没食子酸酯、山柰酚-3-O-芸香糖苷、儿茶素-3-O-没食子酸酯、槲皮素-3-O-芸香糖苷、山柰酚和槲皮素。
4.结论
黑茶因具有茶多酚、茶色素、茶多糖等功能性成分7，具有明显减肥、助消化、抗氧化、抗菌等功能8。本研究利用超高效液相色谱-电喷雾串联飞行时间质谱对安化黑砖茶进行分析，并基于UNIFI软件精确分子量筛查功能对黑砖茶样品溶液中的所含化学成分进行鉴定，共计筛查出12个化合物，该方法快速准确，可为安化黑茶的鉴定提供及手段，同时为其质量标准的建立提供科学依据。
参考文献
[1]黄皓，翁昆.我国地理标志产品和茶叶产品保护的现状[J].中国茶叶加工，2010（1）：8-11.
[2]萧力争，郭则之，谭振初.湖南黑茶花色品种的发生与发展史略[J].中国茶叶加工，2007（4）：50-52.
[3]孟涛，邹勋.安化黑茶产业现状与发展策略[J].茶叶通讯，2011，38（1）：17-20.
[4]钟新菊，谢恒铨.茶叶审评的内容与应注意的若干问题[J].福建茶叶，2011，33（2）：31-32.
[5]颜鸿飞，王美玲，邹灿， et al. LC-IT-TOF MS法分析湖南黑茶中水溶性成分[J].化学分析计量，2017（3）：22-26.
[6]L.Deng，A.M.Shi，H.Z.Liu，N.Meruva，L.Liu，H.Hu，Y.Yang，C.Huang，P.Li and Q.Wang，"Identification of chemical ingredients of peanut stems and leaves extracts using uplc-qtof-ms coupled with novel informatics unifi platform"，Journal of mass spectrometry，Vol.51，no.12，pp.1157-1167，2016.
[7]黃业伟，杨晓颖，向泽敏，et al.黑茶化学成分分析研究进展[J].食品界，2019（2）：79-80.
[8]何煜波，姜爱丽，胡文忠，et al.黑茶加工工艺与保健功能研究[J].安徽农业科学，2012（27）：13595-13597.
作者简介：
唐敏（1984-），男，博士，讲师，从事中药作用物质基础及作用机理研究。
基金项目：湖南省教育厅科研项目（15C1379）