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【摘要】高内涵成像分析系统目前已成为药物筛选、细胞生物学功能研究的常用技术，广泛应用至肿瘤、干细胞、炎症、靶点验证、免疫性疾病和新药研发等研究领域。文章简要概述了高内涵系统的原理，并对其在细胞周期、凋亡、细胞毒性、细胞迁移等方面的研究进展作一综述。
【关键词】高内涵成像分析系统;药物筛选;应用
Abstract： High content imaging analysis system （HCA） has become the common technology in drug screening and cell biology function research， which has been widely used in the field of tumors， stem cells， inflammatory， autoimmune disease， target validation， autoimmune disease and drug development. This paper summarizes the principle of the HCA， as well as the research developments in the research of cell cycle， apoptosis， cell toxicity， migration.
Key words： high content imaging analysis system; drug screening; application
【中图分类号】F763 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）06-041-03
0引言
细胞成像技术已成为细胞生物学、肿瘤生物学等许多相关研究领域的常用技术，成像技术可以将由简至繁的疾病、细胞、生物和化学事件可视化，观察简单、快速。但无法进行单细胞水平的批量参数分析。作为细胞生物学功能研究的另一种常用技术，流式细胞分析技术（flow cytometry， FCM）可以对荧光标记的单细胞或颗粒进行定量分析，具有高速、精准等优点，但无法同时获得图像，会丢失细胞形态、结构、动态变化、3D结构等信息。
高内涵成像分析系统（High Content Analysis， HCA）可以结合细胞成像技术和流式细胞技术的优点，进行全自动高通量荧光显微成像及多参数定量图像分析，为科研提供了快速有效的工具，目前已应用至肿瘤、干细胞、炎症、免疫性疾病、靶点验证和新药研发等研究领域，成为细胞生物学功能研究的常用技术[1-5]。HCA图像分析软件具有智能化参数处理模块，采用以细胞数据库为基础的计算模型，大大提高了对复杂图像的批量分析能力。文章概述了高内涵细胞成像系统的技术原理，并根据我们的实验经验对影响实验结果的因素进行总结和讨论，最后对其在细胞周期、细胞毒性、细胞迁移等方面的应用进展作一综述。
1 HCA的技术原理
1.1 HCA的概念。
高内涵系统也被称为高内涵筛选，其概念早在20世纪80年代就被提出[6]，早期应用于药物发现领域，现在已广泛应用于肿瘤学、免疫学、毒理学、药学、神经生物学等多个领域[7-12]。HCA能够在保持细胞结构和功能完整的前提下，对细胞、亚细胞及3D微组织进行多通道的自动化成像，获得单细胞水平的细胞形态、荧光强度、细胞动态等多维参数[13-15]。
1.2 HCA的实验流程。
HCA的实验流程包括高内涵成像样品的准备、获取明场或荧光图像、高内涵数据分析。（1）样品准备
样品准备包括微孔板选择和细胞培养和荧光标记。高内涵的成像孔板包括6-384孔板，贴壁细胞的培养适合选择TC-treated孔板，保证细胞贴壁良好，普通多孔板厚度约为 1um，适合于低倍镜拍摄。分析细胞浓度、形态时可以选择普通多孔板，但在观察细胞器结构等需要更好成像效果的实验以及需要使用高倍镜如40倍、63倍镜时，都适合选择薄底板。微孔板常用有聚苯乙烯材质和玻璃材質，玻璃材质相对透光性更好，但不合适贴壁细胞的培养，可以对微孔板进行特殊处理，如用明胶、胶原等包被[16，17]。细胞需均匀单层铺板，铺板时优化细胞浓度，控制细胞生长时间，保证检测时细胞密度不超过75%，以确保分析时细胞拆分准确。细胞处理和荧光标记时需参考文献确定药物浓度、处理时间、抗体染料浓度等。
（2）图像获取
随着高内涵系统和显微镜领域的发展，HCA设备在光源、采集装置等配置上都有了很大提高。HCA具有宽场、明场、共聚焦三种成像方式，宽场成像视野大、速度快，但存在较大的背景噪声，且成像深度不够。共聚焦成像可以去除非焦平面的信号，使得其对比度和分辨率更高，但共聚焦成像需要更长的曝光时间或能量更强的激发光，造成对细胞的光毒性和光淬灭性更大。所以对于易淬灭荧光样品及活细胞长时间动态观察的实验，合适选择宽场成像，对于厚样本和微组织3D成像适合选择共聚焦成像模式。
（3）数据分析
HCA的分析软件可对同一实验的多参数、多维度数据进行自动化定量分析，包括对细胞个体或群体进行靶标分子定量检测和表型检测，以及进行大数据生物信息学分析。分析系统预设几十种复杂而精确的算法对图像进行运算获得数百种图像参数，从而挖掘生物学相关信息。目前常用的分析软件有PerkinElmer公司的Columbus、Operetta、High content profiler以及Thermo Fisher公司的HCS Studio细胞分析软件、Store图像及数据库管理软件等。
2 HCA在药物筛选领域的应用
2.1 细胞周期 肿瘤治疗中最重要的治疗策略之一就是针对细胞增殖与细胞分裂进行抑制。这两者都可以使用高内涵多标记细胞成像方式检测[18]。崔巍等[19]采用应用高内涵技术对心肌成纤维细胞增殖和细胞周期进行分析，检测了 BrdU阳性比例细胞各分裂时期细胞百分比，将各项参数与流式细胞分析结果对比发现没有统计学差异，证明了高内涵系统能精确、量化地分析细胞增殖。段绍维等[20]利用高内涵系统获得有丝分裂指数、微管、纺锤体形成等细胞周期评价指标，分析了土槿皮乙酸对人乳腺癌细胞周期的影响。Gasparri等[21]利用高内涵系统分析了BrdU阳性的细胞比例、细胞核荧光强度等增殖参数，研究生长因子和血清刺激后人皮肤成纤维的增殖情况。
2.2 细胞凋亡
细胞凋亡是一个与基因的激活、表达、调控等复杂作用相关的过程，所以对于凋亡的检测评价参数应是多维度的。目前对于凋亡的研究主要在形态学和生物化学水平上的变化，形态学变化包括核皱缩、核膜破碎、线粒体形态变化、凋亡小体出现等。生物化学上的变化包括染色质的DNA断裂、线粒体膜电位变化、胞膜渗透性变化、caspases （半胱天冬酶）的激活等。乔可等[22]应用高内涵的活细胞长时间成像模块通过检测细胞数、细胞核的荧光强度、细胞核尺寸、细胞核的碎片化等多种参数，研究了小鼠神经瘤母细胞经谷氨酸处理后的形态学变化特征。任艳青等[23]利用高内涵系统通过检测线粒体膜电位、膜通透性、核DNA 含量、核形态、细胞数量等参数的变化研究了黄芩配方颗粒对人肝癌 HepG2细胞凋亡的影响。
2.3 细胞毒性
在药物研发过程中，能够及时对早期毒性指标进行检测是非常重要的一部分。李丹丹等[24]用生首乌醇提物和制首乌醇提物处理人源性肝癌细胞Hep G2，利用高内涵系统获得细胞数、胞内转录调控因子、线粒体功能相关参数等检测指标，证明两种药物的肝毒性与细胞凋亡具有很大的相关性。利用高内涵的活细胞长时间成像模式监测药物细胞毒性的研究也很多。高阳[25]等利用高内涵系统动态观察药物处理后的Hep G2细胞数、核DNA含量、谷胱甘肽水平、活性氧水平、线粒体膜电位等5个参数，对药物的细胞毒性作用进行定量分析。
2.4细胞迁移
肿瘤转移是恶性肿瘤重要的生物学特性，研究肿瘤转移过程及分子机制对于临床治疗有重要意义。研究者开始利用高内涵系统对单细胞进行长时间实时追踪，分析细胞运动的距离、速度、偏转角度等迁移参数。王睿[26]采用transwell实验利用高内涵系统长时间动态检测2种黄酮类化合物处理后胃癌细胞的迁移情况，研究发现两种化合物均能抑制胃癌细胞的迁移能力。近年来对于miRNA在肿瘤治疗中的研究越来越多，研究表明miRNA在肿瘤细胞增殖、迁移等过程中起到重要调控作用，对于肿瘤治疗具有重要意义。常颜信[27]利用高内涵系统筛选出17个与胆囊癌转移相关的miRNAs。Zhang H S[28]等对癌细胞中参与调控细胞迁移的miRNAs利用高内涵系统进行检测，发现在各种不同类型的癌细胞中超过20%的miRNAs对细胞的迁移能力产生影响。
3 结语
近年来，高内涵系统因其高通量、高效率等优势已在肿瘤研究、新药研发等方面得到广泛应用。高内涵系統可以在一次实验中获得多靶点、多维度且同时涉及形态学和生物化学水平的参数，其配置的活细胞工作站模块可以对细胞的生长、迁移等活动进行长时间动态监测，复杂、智能的自动化分析软件为研究者提供精确、可靠的数据。因此，高内涵技术已成为药物筛选和细胞生物学领域的重要技术手段。
【参考文献】
[1]LINZ S， SCHORPPZ K， ROTHENAIGNER I， et al. Image-based high-content screening in drug discovery [J]. Drug Discovery Today， 2021， 25（8）：1348-1361
[2]SOMMER C， HOEFLER R， SAMWER M， et al. A deep learning and novelty detection framework for rapid phenotyping in high-content screening[J]. Molecular Biology of the Cell， 2017， 28（23） ： 3428.
[3]CHAMBERS K M， MANDAVILLI B S， DOLMAN N J， et al. General staining and segmentation procedures for high content imaging and analysis[M].Methods in Molecular Biology， 2018， 1683： 21-31.
[4]JOY M E， VOLLMER L L，HULKOWER K， et al. A high-content， multiplexed screen in human breast cancer cells identifies profilin-1 inducers with anti-migratory activities. [J]. PLoS ONE， 2017， 9（2）： e88350
[5]KICHEOL H， DAECHAN P， SHINYEONG J， et al. Streamlined selection of cancer antigens for vaccine development through integrative multi-omics and high-content cell imaging[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）：5885. [6]GIULIANO KA，DEBIASIO RL，DUNLAY RT，et al. High-content screening： a new approach to easing key bottlenecks in the drug discovery process [J]. J Biomol Screen，1997，2：249-259
[7]GUO J Y， WANG P Z， SOZEN B， et al. Machine learning-assisted high-content analysis of pluripotent stem cell-derived embryos in vitro [J]. Stem Cell Reports， 2021， DOI： 10.1016/J.STEMCR.2021.03.018.
[8]DARKO S， GEORGE T， KOLJA W， et al. Prostate cancer diagnosis using epigenetic biomarkers， 3D high-content imaging and probabilistic cell-by-cell classifiers [J]. Oncotarget， 2017， 8（34）： 57278-57301.
[9]ALEXANDER G F， YASUHIRO I， OKSANA S， et al. High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes [J]. ASSAY and Drug Development Technologies， 2015， 13（9）：529-546.
[10]CARLSSON A， KUHN P， LUTTGEN M S， et al. Paired High-Content Analysis of Prostate Cancer Cells in Bone Marrow and Blood Characterizes Increased Androgen Receptor Expression in Tumor Cell Clusters[J]. Clinical Cancer Research， 2017， 23（7）：172-1732.
[11]THORNE N， MALIK N， SHAH S， et al. High-throughput phenotypic screening of human astrocytes to identify compounds that protect against oxidative stress [J]. Stem Cells Transl Med， 2016， 5（5）： 613-627.
[12]CARTER C A. Multiplexed high content screening reveals that cigarette smoke condensate-altered cell signaling pathway are accentuated through FAK inhibition in human bronchial cells [J] . International Journal of Toxicology， 2012， 31（3）： 257-266.
[13]SINGH S，CARPENTER A E，GENOVESIO A. Increasing the content of high-content screening： An overview [J]. Journal of Biomolecular Screening， 2014， 19（5）：640-650
[14]陳凯先，蒋华良，罗小民，等.后基因组时代的药物发现：趋势和实践[J].中国天然药物， 2004， 2（5）：257-260
[15]GIULIANO K A，HASKINS J R，TAYLOR D L. Advances in high content screening for drug discovery [J]. Assay Drug Dev Technol， 2003， 1（4）：565-577
[16]VOZZI G，LENZI T，MONTEMURRO F，et al. A novel method to produce immobilised biomolecular concentration gradients to study cell activities： design and modelling [J]. Mol Biotechnol， 2012， 50（2）：：99-107
[17]SUN Y，HUANG Z，YANG K ，et al. Surface coating as a key parameter in engineering neuronal network structures in vitro [J]. Biointerphases， 2012， 7（1-4）：29
[18]GASPARRI F，CAPELLA P，GALVANI A. Multiparametric cell cycle analysis by automated microscopy [J]. Journal of Biomolecular Screening， 2006， 11（6）：586 [19]崔巍，李玉琳，吴依娜，等.高内涵筛选与流式细胞分析技术在心肌成纤维细胞增殖研究中的应用[J].生理学报， 2014， 66（2）：215-222
[20]段绍维，徐波，陈云利，等.高内涵法探讨土槿皮乙酸对MCF-7 细胞抑制作用的机制[J].生物化学与生物物理进展， 2010， 37（12）：1313-1322
[21]GASPARRI F， MARIANI M， SOLA F， et al. Quantification of the proliferation index of human dermal fibroblast cultures with the ArrayScan high-content screening reader [J]. Drug Discovery Today， 2004， Suppl（3）：31
[22]乔可，崔士超，胡捷先，等.高内涵筛选结合活细胞实时成像技术分析谷氨酸诱导的小鼠神经瘤母细胞N2a凋亡[J].复旦学报， 2015， 42（4）：538-542
[23]任艳青，田宇柔，牛丽颖，等.黄芩配方颗粒调控 HepG2 细胞增殖与凋亡的机制[J].北京中医药大学学报， 2016， 10（39）：844-849
[24]李丹丹，汤响，林龙隆，等.基于高内涵筛选技术研究生首乌和制首乌醇提物的肝毒性机制[J].中国药理学与毒理学杂志， 2017， 31（6）：1000-3002
[25]高阳，胡宇驰，左泽平.应用高内涵分析技术进行药物肝毒性风险评估的研究[J].药学研究， 2015， 12：688-691
[26]王睿.Genistein及其改构体KBU2046对胃癌细胞的转移抑制作用及机制研究[D].第四军医大学， 2014
[27]常颜信. 胆囊癌转移相关miRNAs的高内涵筛选及功能和机制研究[D].第二军医大学，2013
[28]ZHANG H S，HAO Y，YANG J Y，et al. Genome-wide functional screening of miR-23b as a pleiotropic modulator suppressing cancer metastasis [J]. Nature Communications， 2011 ， 2（1）：554
基金项目：浙江中医药大学科研项目资助（批准号：2020ZY19）
作者简介：唐梅，1987.08，女，汉族，安徽合肥人，硕士，助理实验师，研究方向：细胞与分子生物學。
*通讯作者：于晓凤，1989.11，女，汉族，山东莱西人，硕士，助理实验师，研究方向：细胞与分子生物学。
浙江中医药大学中医药科学院 杭州 310053
【关键词】高内涵成像分析系统;药物筛选;应用
Abstract： High content imaging analysis system （HCA） has become the common technology in drug screening and cell biology function research， which has been widely used in the field of tumors， stem cells， inflammatory， autoimmune disease， target validation， autoimmune disease and drug development. This paper summarizes the principle of the HCA， as well as the research developments in the research of cell cycle， apoptosis， cell toxicity， migration.
Key words： high content imaging analysis system; drug screening; application
【中图分类号】F763 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2021）06-041-03
0引言
细胞成像技术已成为细胞生物学、肿瘤生物学等许多相关研究领域的常用技术，成像技术可以将由简至繁的疾病、细胞、生物和化学事件可视化，观察简单、快速。但无法进行单细胞水平的批量参数分析。作为细胞生物学功能研究的另一种常用技术，流式细胞分析技术（flow cytometry， FCM）可以对荧光标记的单细胞或颗粒进行定量分析，具有高速、精准等优点，但无法同时获得图像，会丢失细胞形态、结构、动态变化、3D结构等信息。
高内涵成像分析系统（High Content Analysis， HCA）可以结合细胞成像技术和流式细胞技术的优点，进行全自动高通量荧光显微成像及多参数定量图像分析，为科研提供了快速有效的工具，目前已应用至肿瘤、干细胞、炎症、免疫性疾病、靶点验证和新药研发等研究领域，成为细胞生物学功能研究的常用技术[1-5]。HCA图像分析软件具有智能化参数处理模块，采用以细胞数据库为基础的计算模型，大大提高了对复杂图像的批量分析能力。文章概述了高内涵细胞成像系统的技术原理，并根据我们的实验经验对影响实验结果的因素进行总结和讨论，最后对其在细胞周期、细胞毒性、细胞迁移等方面的应用进展作一综述。
1 HCA的技术原理
1.1 HCA的概念。
高内涵系统也被称为高内涵筛选，其概念早在20世纪80年代就被提出[6]，早期应用于药物发现领域，现在已广泛应用于肿瘤学、免疫学、毒理学、药学、神经生物学等多个领域[7-12]。HCA能够在保持细胞结构和功能完整的前提下，对细胞、亚细胞及3D微组织进行多通道的自动化成像，获得单细胞水平的细胞形态、荧光强度、细胞动态等多维参数[13-15]。
1.2 HCA的实验流程。
HCA的实验流程包括高内涵成像样品的准备、获取明场或荧光图像、高内涵数据分析。（1）样品准备
样品准备包括微孔板选择和细胞培养和荧光标记。高内涵的成像孔板包括6-384孔板，贴壁细胞的培养适合选择TC-treated孔板，保证细胞贴壁良好，普通多孔板厚度约为 1um，适合于低倍镜拍摄。分析细胞浓度、形态时可以选择普通多孔板，但在观察细胞器结构等需要更好成像效果的实验以及需要使用高倍镜如40倍、63倍镜时，都适合选择薄底板。微孔板常用有聚苯乙烯材质和玻璃材質，玻璃材质相对透光性更好，但不合适贴壁细胞的培养，可以对微孔板进行特殊处理，如用明胶、胶原等包被[16，17]。细胞需均匀单层铺板，铺板时优化细胞浓度，控制细胞生长时间，保证检测时细胞密度不超过75%，以确保分析时细胞拆分准确。细胞处理和荧光标记时需参考文献确定药物浓度、处理时间、抗体染料浓度等。
（2）图像获取
随着高内涵系统和显微镜领域的发展，HCA设备在光源、采集装置等配置上都有了很大提高。HCA具有宽场、明场、共聚焦三种成像方式，宽场成像视野大、速度快，但存在较大的背景噪声，且成像深度不够。共聚焦成像可以去除非焦平面的信号，使得其对比度和分辨率更高，但共聚焦成像需要更长的曝光时间或能量更强的激发光，造成对细胞的光毒性和光淬灭性更大。所以对于易淬灭荧光样品及活细胞长时间动态观察的实验，合适选择宽场成像，对于厚样本和微组织3D成像适合选择共聚焦成像模式。
（3）数据分析
HCA的分析软件可对同一实验的多参数、多维度数据进行自动化定量分析，包括对细胞个体或群体进行靶标分子定量检测和表型检测，以及进行大数据生物信息学分析。分析系统预设几十种复杂而精确的算法对图像进行运算获得数百种图像参数，从而挖掘生物学相关信息。目前常用的分析软件有PerkinElmer公司的Columbus、Operetta、High content profiler以及Thermo Fisher公司的HCS Studio细胞分析软件、Store图像及数据库管理软件等。
2 HCA在药物筛选领域的应用
2.1 细胞周期 肿瘤治疗中最重要的治疗策略之一就是针对细胞增殖与细胞分裂进行抑制。这两者都可以使用高内涵多标记细胞成像方式检测[18]。崔巍等[19]采用应用高内涵技术对心肌成纤维细胞增殖和细胞周期进行分析，检测了 BrdU阳性比例细胞各分裂时期细胞百分比，将各项参数与流式细胞分析结果对比发现没有统计学差异，证明了高内涵系统能精确、量化地分析细胞增殖。段绍维等[20]利用高内涵系统获得有丝分裂指数、微管、纺锤体形成等细胞周期评价指标，分析了土槿皮乙酸对人乳腺癌细胞周期的影响。Gasparri等[21]利用高内涵系统分析了BrdU阳性的细胞比例、细胞核荧光强度等增殖参数，研究生长因子和血清刺激后人皮肤成纤维的增殖情况。
2.2 细胞凋亡
细胞凋亡是一个与基因的激活、表达、调控等复杂作用相关的过程，所以对于凋亡的检测评价参数应是多维度的。目前对于凋亡的研究主要在形态学和生物化学水平上的变化，形态学变化包括核皱缩、核膜破碎、线粒体形态变化、凋亡小体出现等。生物化学上的变化包括染色质的DNA断裂、线粒体膜电位变化、胞膜渗透性变化、caspases （半胱天冬酶）的激活等。乔可等[22]应用高内涵的活细胞长时间成像模块通过检测细胞数、细胞核的荧光强度、细胞核尺寸、细胞核的碎片化等多种参数，研究了小鼠神经瘤母细胞经谷氨酸处理后的形态学变化特征。任艳青等[23]利用高内涵系统通过检测线粒体膜电位、膜通透性、核DNA 含量、核形态、细胞数量等参数的变化研究了黄芩配方颗粒对人肝癌 HepG2细胞凋亡的影响。
2.3 细胞毒性
在药物研发过程中，能够及时对早期毒性指标进行检测是非常重要的一部分。李丹丹等[24]用生首乌醇提物和制首乌醇提物处理人源性肝癌细胞Hep G2，利用高内涵系统获得细胞数、胞内转录调控因子、线粒体功能相关参数等检测指标，证明两种药物的肝毒性与细胞凋亡具有很大的相关性。利用高内涵的活细胞长时间成像模式监测药物细胞毒性的研究也很多。高阳[25]等利用高内涵系统动态观察药物处理后的Hep G2细胞数、核DNA含量、谷胱甘肽水平、活性氧水平、线粒体膜电位等5个参数，对药物的细胞毒性作用进行定量分析。
2.4细胞迁移
肿瘤转移是恶性肿瘤重要的生物学特性，研究肿瘤转移过程及分子机制对于临床治疗有重要意义。研究者开始利用高内涵系统对单细胞进行长时间实时追踪，分析细胞运动的距离、速度、偏转角度等迁移参数。王睿[26]采用transwell实验利用高内涵系统长时间动态检测2种黄酮类化合物处理后胃癌细胞的迁移情况，研究发现两种化合物均能抑制胃癌细胞的迁移能力。近年来对于miRNA在肿瘤治疗中的研究越来越多，研究表明miRNA在肿瘤细胞增殖、迁移等过程中起到重要调控作用，对于肿瘤治疗具有重要意义。常颜信[27]利用高内涵系统筛选出17个与胆囊癌转移相关的miRNAs。Zhang H S[28]等对癌细胞中参与调控细胞迁移的miRNAs利用高内涵系统进行检测，发现在各种不同类型的癌细胞中超过20%的miRNAs对细胞的迁移能力产生影响。
3 结语
近年来，高内涵系统因其高通量、高效率等优势已在肿瘤研究、新药研发等方面得到广泛应用。高内涵系統可以在一次实验中获得多靶点、多维度且同时涉及形态学和生物化学水平的参数，其配置的活细胞工作站模块可以对细胞的生长、迁移等活动进行长时间动态监测，复杂、智能的自动化分析软件为研究者提供精确、可靠的数据。因此，高内涵技术已成为药物筛选和细胞生物学领域的重要技术手段。
【参考文献】
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[22]乔可，崔士超，胡捷先，等.高内涵筛选结合活细胞实时成像技术分析谷氨酸诱导的小鼠神经瘤母细胞N2a凋亡[J].复旦学报， 2015， 42（4）：538-542
[23]任艳青，田宇柔，牛丽颖，等.黄芩配方颗粒调控 HepG2 细胞增殖与凋亡的机制[J].北京中医药大学学报， 2016， 10（39）：844-849
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基金项目：浙江中医药大学科研项目资助（批准号：2020ZY19）
作者简介：唐梅，1987.08，女，汉族，安徽合肥人，硕士，助理实验师，研究方向：细胞与分子生物學。
*通讯作者：于晓凤，1989.11，女，汉族，山东莱西人，硕士，助理实验师，研究方向：细胞与分子生物学。
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