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摘要：利用经典实验方法显示碱性蛋白实验结果与理论上存在较大的偏差，通过对碱性固绿的浓度、PH值，抽提和染色时间的调整，对实验方法进行了改进，获得了较为理想的实验结果。该方法可应用于实验教学中，有利于加深学生对碱性蛋白分布情况的理解。
关键词碱性蛋白；PH值；碱性固绿；改进
中国分类号：Q24
碱性蛋白的显示是《医学细胞生物学》实验中的经典实验，选用蟾蜍血细胞作为实验材料，利用细胞化学法对碱性蛋白进行定位、定性的分析。通过实验，学生可掌握蟾蜍的处死和解剖，血涂片的制作技巧，并了解碱性蛋白呈色反应的原理及步骤，熟悉碱性蛋白在细胞内的分布情况。多年来本实验的实验效果一直不佳，与理论上存在较大偏差，细胞核着色不明显，碱性蛋白未能准确显示出来。因此，作者在《细胞生物学》的实验教学中，通过对染料浓度及PH值，抽提时间，染色时间等进行不断的探索和改进，取得了更为理想的实验结果。
一、材料与方法
1.1实验动物
选用蟾蜍，体重28±2g。
1.2主要药品与器材
固绿（上海源叶生物技术有限公司，批号：F20121215）；三氯醋酸，95%乙醇（天津市大茂化学试剂厂）；眼科剪；眼科镊；双目光学显微镜（重庆奥特光学仪器，型号：SMARTe-320）。
1.3方法
（1）制作血涂片：采用双毁髓法处死蟾蜍后解剖，暴露心脏，打开心包膜，用洁净的载玻片一端蘸取血液，于另一张洁净的载玻片上制成血涂片，室温晾干。
（2）固定：血膜干后置于95%乙醇中固定5min，取出后室温晾干。（3）抽提核酸：将标本置于70℃三氯醋酸中处理10min，取出标本流水反复冲洗，晾干。（4）染色：于浓度为1%，PH值为10.0的碱性固绿染液中进行染色30min。（5）冲洗，晾干，镜检。
二、结果
经典实验方法制得的标本中，血细胞中细胞核和细胞质均被染成绿色，细胞核与细胞质界限不清晰，着色不鲜明，碱性蛋白显示不明显，实验效果不理想。改进后实验方法制作的标本中，可见细胞核染成鲜艳的绿色，而细胞质几乎无色，核质分明，着色清晰，碱性蛋白显色明显，见图1。
三、讨论
不同的氨基酸带有不同的化学性质的侧链基团，有的带碱性侧链，有的带酸性侧链。而不同的蛋白质因拥有不同数目的碱性基团和酸性基团，从而在不同的PH溶液中带有不同的净电荷。如在生理条件下，整个蛋白质分子带负电荷多则为酸性蛋白，带正电荷多则为碱性蛋白，如组蛋白、精蛋白等[1]。因此，标本经三氯醋酸处理后，用带负电荷多的碱性固绿染液进行染色，可使在此PH环境中带正电荷多的碱性蛋白被显示出来。细胞中含量最多的碱性蛋白是组蛋白，其与DNA紧密包裹形成的染色质，主要存在于真核细胞的细胞核内[2]。因此，经碱性固绿染色的标本主要是细胞核被染成绿色。然而在实验教学实践过程中，实验结果往往出现较大的偏差，不利于学生观察。对此，作者在以下三方面进行了改进：（1）将碱性固绿的浓度由0.1%调整到1%，并将PH值由8.5提高到10.0，以加大碱性固绿染液中负电荷的数量，从而使细胞核着色更深。（2）三氯醋酸可使蛋白质沉淀下来，并溶解细胞内核酸以消除影响。抽提时间不够核酸溶解不充分，影响着色效果；抽提时间太长影响实验流程，浪费时间。作者通过不同抽提时间（5，10，15，20min）实验比较发现，抽提10min既可保证实验效果又可有效节省时间。（3）针对细胞核着色浅的问题，作者通过摸索不同染色时间（20，25，30，35min）对实验结果的影响后发现，染色时间太短导致碱性固绿不能有效的进入到细胞核内，使碱性蛋白未能着色。因此，应延长染色时间以保证碱性固绿能充分的进入到细胞核内与碱性蛋白结合。为了提高实验操作效率，经过多次反复实验比较，作者选择了染色30min，可获得理想的实验结果。
经改进后的实验方法可获得染色清晰，着色鲜明的碱性蛋白显示标本，结果稳定，可应用于实验教学中，有一定实用价值。
参考文献
[1]章静波，黄东阳，方瑾等.细胞生物学实验技术[M]，北京：化学工业出版社，2006.38-39.
[2]杨抚华，胡以平，胡火珍等.医学细胞生物学[M]，北京：科学出版社，2010.243.
作者简介：刘星（1983年-），女，湖南长沙，硕士研究生，实验师，研究方向：细胞生物学，遗传学实验教学及科研工作。
关键词碱性蛋白；PH值；碱性固绿；改进
中国分类号：Q24
碱性蛋白的显示是《医学细胞生物学》实验中的经典实验，选用蟾蜍血细胞作为实验材料，利用细胞化学法对碱性蛋白进行定位、定性的分析。通过实验，学生可掌握蟾蜍的处死和解剖，血涂片的制作技巧，并了解碱性蛋白呈色反应的原理及步骤，熟悉碱性蛋白在细胞内的分布情况。多年来本实验的实验效果一直不佳，与理论上存在较大偏差，细胞核着色不明显，碱性蛋白未能准确显示出来。因此，作者在《细胞生物学》的实验教学中，通过对染料浓度及PH值，抽提时间，染色时间等进行不断的探索和改进，取得了更为理想的实验结果。
一、材料与方法
1.1实验动物
选用蟾蜍，体重28±2g。
1.2主要药品与器材
固绿（上海源叶生物技术有限公司，批号：F20121215）；三氯醋酸，95%乙醇（天津市大茂化学试剂厂）；眼科剪；眼科镊；双目光学显微镜（重庆奥特光学仪器，型号：SMARTe-320）。
1.3方法
（1）制作血涂片：采用双毁髓法处死蟾蜍后解剖，暴露心脏，打开心包膜，用洁净的载玻片一端蘸取血液，于另一张洁净的载玻片上制成血涂片，室温晾干。
（2）固定：血膜干后置于95%乙醇中固定5min，取出后室温晾干。（3）抽提核酸：将标本置于70℃三氯醋酸中处理10min，取出标本流水反复冲洗，晾干。（4）染色：于浓度为1%，PH值为10.0的碱性固绿染液中进行染色30min。（5）冲洗，晾干，镜检。
二、结果
经典实验方法制得的标本中，血细胞中细胞核和细胞质均被染成绿色，细胞核与细胞质界限不清晰，着色不鲜明，碱性蛋白显示不明显，实验效果不理想。改进后实验方法制作的标本中，可见细胞核染成鲜艳的绿色，而细胞质几乎无色，核质分明，着色清晰，碱性蛋白显色明显，见图1。
三、讨论
不同的氨基酸带有不同的化学性质的侧链基团，有的带碱性侧链，有的带酸性侧链。而不同的蛋白质因拥有不同数目的碱性基团和酸性基团，从而在不同的PH溶液中带有不同的净电荷。如在生理条件下，整个蛋白质分子带负电荷多则为酸性蛋白，带正电荷多则为碱性蛋白，如组蛋白、精蛋白等[1]。因此，标本经三氯醋酸处理后，用带负电荷多的碱性固绿染液进行染色，可使在此PH环境中带正电荷多的碱性蛋白被显示出来。细胞中含量最多的碱性蛋白是组蛋白，其与DNA紧密包裹形成的染色质，主要存在于真核细胞的细胞核内[2]。因此，经碱性固绿染色的标本主要是细胞核被染成绿色。然而在实验教学实践过程中，实验结果往往出现较大的偏差，不利于学生观察。对此，作者在以下三方面进行了改进：（1）将碱性固绿的浓度由0.1%调整到1%，并将PH值由8.5提高到10.0，以加大碱性固绿染液中负电荷的数量，从而使细胞核着色更深。（2）三氯醋酸可使蛋白质沉淀下来，并溶解细胞内核酸以消除影响。抽提时间不够核酸溶解不充分，影响着色效果；抽提时间太长影响实验流程，浪费时间。作者通过不同抽提时间（5，10，15，20min）实验比较发现，抽提10min既可保证实验效果又可有效节省时间。（3）针对细胞核着色浅的问题，作者通过摸索不同染色时间（20，25，30，35min）对实验结果的影响后发现，染色时间太短导致碱性固绿不能有效的进入到细胞核内，使碱性蛋白未能着色。因此，应延长染色时间以保证碱性固绿能充分的进入到细胞核内与碱性蛋白结合。为了提高实验操作效率，经过多次反复实验比较，作者选择了染色30min，可获得理想的实验结果。
经改进后的实验方法可获得染色清晰，着色鲜明的碱性蛋白显示标本，结果稳定，可应用于实验教学中，有一定实用价值。
参考文献
[1]章静波，黄东阳，方瑾等.细胞生物学实验技术[M]，北京：化学工业出版社，2006.38-39.
[2]杨抚华，胡以平，胡火珍等.医学细胞生物学[M]，北京：科学出版社，2010.243.
作者简介：刘星（1983年-），女，湖南长沙，硕士研究生，实验师，研究方向：细胞生物学，遗传学实验教学及科研工作。