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【中图分类号】R969【文献标识码】A【文章编号】1008-0465（2013）-09-0232-03
【摘要】目的探讨地西泮干预治疗幼鼠早期癫痈持续状态（SE）对成鼠后海马结构损伤的远期保护作用。方法健康生后20～25 d的Wistar幼鼠36只，随机分为生理盐水对照组、地西泮干预组和氯化锂一匹罗卡品腹腔注射诱导的癫痈持续状态组，并持续追踪至成鼠阶段，应用常规病理及Nissl氏染色观察海马结构的形态学改变，同时应用Timm组织化学染色方法进行苔藓纤维发芽的研究。结果SE幼鼠发育至成鼠阶段后，在海马结构的神经元仍可见到变性和坏死性改变，以CAI区、CA3区和齿状回为重。Timm染色见CA3区有苔藓纤维发芽现象。生理盐水对照组和地西泮干预组均未见海马结构损伤性改变以及苔藓纤维发芽现象。结论地西泮干预治疗能够有效地对幼鼠早期癫痈持续状态后成鼠的海马结构起到神经保护作用。
【关键词】地西泮；癫痈持续状态；海马硬化；苔藓纤维发芽；氯化锂-匹罗卡品
文献报道：约有60%～70%的癫痫患者伴有一侧海马硬化。海马内苔藓状纤维 （mossy fiber， MF）发芽是癫痫时普遍存在的病理现象。海马硬化的特征是神经元脱失和苔藓状纤维发芽所致的神经胶质增生，病变累及到海马的CAl区、CA3，CA4区、下托和齿状回，CA2区相对不受累，在严重的病例其病理改变更加广泛[1]。在临床工作中，对于急性发作的癫痫持续状态（status eDileDtiCUS .SE）病人.首选治疗药物是地西泮。地西泮对幼鼠SE海马结构的近期保护作用已经得到证实[2]，但诱导SE物质对海马结构有无远期损伤作用、幼年早期SE后采用地西泮干预治疗，对海马结构有无长期的脑保护作用，以及它能否有预防大脑易损结构的远期损伤效应，即预防海马硬化的发生，一直是人们比较关注的一些问题，但迄今尚未见到有关这方面的报道。为探讨地西泮干预治疗幼年长时间反复痫性发作对成熟后大脑海马结构有何影响，本实验采用氯化锂一匹罗卡品致SE幼鼠模型，并设立地西泮干预治疗组和生理盐水对照组，之后持续追踪幼鼠发育至成鼠阶段，再经常规病理及Nissl氏染色观察海马结构的形态学改变，并应用Timm组织化学染色法进行苔藓纤维发芽方面的观察，以探讨幼鼠早期SE后采用地西泮干预治疗对大脑易损结构的远期影响作用。
1材料与方法
1.1实验动物分组 健康生后20～25 d Wistar雄性幼鼠36只（购自兰州大学医学院实验动物中心），体重42～54 g。随机分成3大组，生理盐水对照组、地西泮干预治疗组和SE组，每组12只。每大组中用于光镜检查、尼氏染色检查各3只，Timm组织化学染色6只。按组别分别处理后的幼鼠一直喂养至成鼠阶段（120d）。
1.2动物模型制作
1.2.1试剂来源及批号：氯化锂：Sjgma化学公司；匹罗卡品：Sigma化学公司；硫化钠：天津市天大化学试剂厂（批号：911125）；阿拉伯树胶粉：徐州化学试剂二厂（批号：9812012，进口分装）：1，4对苯二酚：山东单县有机化工厂（批号：9310）；硝酸银：北京化工厂。
1.2.2动物模型制作及分组①药物性SE组：腹腔注射（ip）氯化锂（：3 mol·L-1·kg-1）18～20h后，给予匹罗卡品ip（30 mg·kg-1，匹罗卡品购于Sigma化学公司）。给药约1530 min后幼鼠出现反复强直一阵挛发作，形成SE[3]。②生理盐水对照组：以相同液体量的生理盐水取代匹罗卡品，其余用药步骤及方法同SE组。③地西泮干预组：在给予匹罗卡品30 min之前给予地西泮（4mg·kg-1，ip），目的是不引起痫性发作，干预匹罗卡品的致痫作用。各组幼鼠饲养给予正常饲料喂养，自由进食，室温22～24℃。亮/暗周期12早/12晚。
1.3标本制备及检测方法与指标
1.3.1各组动物均在成鼠期采用灌流固定处死方法以0.1 g/L水合氯醛ip深麻醉后，开胸暴露心脏，12号注射针头刺入左心室尖部。切开右心耳，0. 4%硫化钠缓冲液及4%多聚甲醛灌注、取脑，4%多聚甲醛后固定，置30%蔗糖4℃过夜。30 um厚冰冻切片，每只动物取二套（各4张）切片分别行Neo-Timm及Nissl染色。
1.3.2Neo-Timm染色暗室中将晾干切片浸入新鲜配制的孵育液（50%阿拉伯胶60 ml，柠檬酸缓冲液10 ml，5.6%氢醒30ml，17%硝酸银1.5ml），置26℃水浴箱孵育40～50min，倾去孵育液，流水冲冼15～20min，脱水，中性树胶封片。光镜下行齿状回内分子层Timm银染苔藓纤维出芽评分。评分标准[3]：0表示未见Ti二颗粒；1表示偶见Timm颗粒不连续分布；2表示较多Timm颗粒不连续分布；3表示Timm颗粒近连续分布；4表示Timm颗粒连续分布；5表示Timm颗粒形成致密的层状带。
1.3.3Nissl染色切片晾干后，放入经预热至500 C的1%甲苯胺兰染色20s ，镜下观察背景呈白色或无色，如染色过深，将切片浸入95%酒精中分色镜下监视至满意效果，脱水、封片。镜下观察并半定量评价CAI、CA3，齿状日、门区及杏仁核、梨状皮层神经细胞丢失程度。
1.4统计学处理内分子层Timm评分比较采用均数士标准差（x±s）表示，利用SPSS for window 11.0统计学软件包进行方差分析、多组均数的两两比较和等级相关分析。以P<0. 05表示差异有显著意义。
2结果
2.1氯化锂一匹罗卡品致SE幼鼠行为观察生理盐水组幼鼠无任何抽搐发作迹象；地西泮干预组幼鼠亦无任何抽搐发作，个别动物仅出现兴奋表现；SE组幼鼠，最初均表现为躁动、搔抓、“洗脸样活动”、面部抽搐、单肢阵挛、湿狗样抖动和平衡失调，之后很快表现肢体强直阵挛伴站立及前肢阵挛，进一步发展达到V级，即全身强直一阵挛发作伴站立、跌倒，呈SE。在幼鼠发育至成鼠阶段，没有对大鼠再进行抽搐行为方面的观察。 2.2神经元损伤Nissl染色显示，对照组、地西泮干预级大鼠CA3，CAI区及齿状分别见大量致密的锥体细胞及颗粒细胞，门区有中等量神经元，排列整齐，形态完整，胞浆内尼氏小体丰富。匹罗卡品实验组，齿状回门区、CAI和CA3区见部分细胞形态不完整，部分细胞肿胀、破裂，细胞轮廓模糊、界限不清，排列紊乱，细胞间距加大，胞浆尼氏小体减少；齿状回颗粒细胞边界不整齐、增宽，排列松散、紊乱，呈现颗粒细胞发散改变；在门区、齿状回分子层、CAI区始层及幅射层出现反应性胶质细胞增多。神经元损伤还涉及到杏仁核、梨状皮层等边缘结构及大脑皮层。
2.3 Tim组织化学染色法观察苔藓纤维发芽SE组的大鼠与生理盐水组、地西泮干预组相比CA3区可见明显的苔藓纤维发芽见图2～4，各组Timm评分结果见表1。生理盐水对照组评分0分7张、1分5张；匹罗卡品实验组评分I分4张、2分5张、3分3张；安定干预组0分6张、1分5张、2分1张。各组数据进行两两比较等级相关分析，结果表明SE组CA3区Timm评分明显高于其它两组，具有统计学意义。而生理盐水组与地西泮干预组相比无统计学差异。在齿状回区，3组几乎都少见有Timm染色颗粒，评分结果见表1，生理盐水组0分10只，1分2只；地西泮干预组0分7只，1分5只；SE组0分6只，1分6只。各组数据进行两两等级相关分析，无统计学差异。
3讨论
Fuerst等[5]观察的结果显示，从海马结构损伤到海马硬化的形成过程可能是一种逐渐进展的情况，患者的痫性发作越早、痫性发作的病程越长，海马硬化的程度越严重。因此，生命早期的一次性长时间抽搐造成的海马结构损伤过程可能是长久的。本实验观察到大部分的SE幼鼠发育至成鼠后，仍然可见到CAI区、CA3区和齿状回有许多神经元发生变性和坏死，说明这些幼鼠致痫后海马结构易损区的损伤性改变一直持续到成鼠阶段。
本实验观察到地西泮干预组的幼鼠发育至成鼠后，不论在光镜还是Nissl染色观察，海马结构未见到任何的损伤性改变，与生理盐水对照组基本相同，说明地西泮及时控制痫性发作，早期干预控制痫性发作具有脑保护作用。在苔藓纤维发芽评分方面亦显示出没有超过3分的标本，提示在生命早期尽早控制痫性发作对减少发育成熟后苔藓纤维发芽和神经突触重组方面具有明显的预防和保护作用，控制了生命早期痫性发作的严重程度，能够减轻或消除海马结构的远期损伤效应。地西泮干预组幼鼠采用的致痫物质同样是匹罗卡品，经追踪至成鼠阶段后对海马结构观察未见有长期的损害作用；说明SE大鼠海马结构损伤性改变是痫性发作本身造成的，而匹罗卡品药物本身对海马结构损伤的可能性不大，因为地西泮干预治疗组的幼鼠几乎没有痫性发作，但匹罗卡品的用量与致痫组相同。
本实验观察到的另一种现象是，一少部分SE幼鼠发育至成鼠后并没有发现海马结构的损伤性改变，CA3区也没有苔藓纤维发芽迹象。说明同等实验背景条件下生命早期的脑损伤事件不一定都能引起海马结构的远期损伤效应，存在着个体差异。这种差异是环境因素所致还是与个体的抵抗能力有关，以及是否遗传因素参与致病过程，还需要不断积累更多的实验资料来进一步加以说明[7]。生命早期一次性长时间抽搐能否引起海马结构的长远期损伤改变是有个体化的，必须不断地意识到生命早期的反复痫性发作对一些易感个体可以产生明显的海马结构易损区的神经元脱失以及神经纤维发芽现象，而且这种损伤性改变能够持续到个体的发育成熟阶段。但如何识别哪些是易受损伤的个体，仍是我们今后需要不断探索和研究的目标，尤其是在基因组工程方面。
参考文献
[1]Liu Z，Mikaiti M，Holmes GL. Mesial temporal sclerosis：pathogenesisand significance[J].Pedi a tr Neurol，2001，12：5
[2]高旭光，吕晓明，刘芳，等.氯化锂一匹罗卡品致痈幼鼠海马结构损伤的形态学及苔藓纤维发芽研究[J].新疆预防医学杂志，2002，19（1）：23
[3]Erdtmann2Vourliotis M，Riechert U，Mayer P，et al.Pentylenetetrazole（PTZ）一induced cfos expression in the hippocampus ofkindled rats is suppressed by concomitant treatment with naloxone[B].Brain Res，1998，792：299
[4]Liu Z，Yang Y， Silveria DC，e t al .Consequence of recurrent seizuresduring early brain development [J].Neuroscience，1990，92：1443
[5]Fuerst D，Shah J，Kupsky WJ，et al.VolumetricdMRI，pathological，and neuropsychological progression in hippocampalsclerosis[J].Neurology，2001，57：184
[6]Wenzel HJ，Born DE，Dubach MF，e t al .Morphological consequencesof temporal lobe seizures in immature monkey[J].Epilepsia，1999，40（Suppl 7）：80
[7]Sutula TP，Hermann B. Progression in mesial temporal lobeepilepsy[J].Ann Nearol，1999，45：553
（收稿日期2013-02-19）（编辑张耀华）
【摘要】目的探讨地西泮干预治疗幼鼠早期癫痈持续状态（SE）对成鼠后海马结构损伤的远期保护作用。方法健康生后20～25 d的Wistar幼鼠36只，随机分为生理盐水对照组、地西泮干预组和氯化锂一匹罗卡品腹腔注射诱导的癫痈持续状态组，并持续追踪至成鼠阶段，应用常规病理及Nissl氏染色观察海马结构的形态学改变，同时应用Timm组织化学染色方法进行苔藓纤维发芽的研究。结果SE幼鼠发育至成鼠阶段后，在海马结构的神经元仍可见到变性和坏死性改变，以CAI区、CA3区和齿状回为重。Timm染色见CA3区有苔藓纤维发芽现象。生理盐水对照组和地西泮干预组均未见海马结构损伤性改变以及苔藓纤维发芽现象。结论地西泮干预治疗能够有效地对幼鼠早期癫痈持续状态后成鼠的海马结构起到神经保护作用。
【关键词】地西泮；癫痈持续状态；海马硬化；苔藓纤维发芽；氯化锂-匹罗卡品
文献报道：约有60%～70%的癫痫患者伴有一侧海马硬化。海马内苔藓状纤维 （mossy fiber， MF）发芽是癫痫时普遍存在的病理现象。海马硬化的特征是神经元脱失和苔藓状纤维发芽所致的神经胶质增生，病变累及到海马的CAl区、CA3，CA4区、下托和齿状回，CA2区相对不受累，在严重的病例其病理改变更加广泛[1]。在临床工作中，对于急性发作的癫痫持续状态（status eDileDtiCUS .SE）病人.首选治疗药物是地西泮。地西泮对幼鼠SE海马结构的近期保护作用已经得到证实[2]，但诱导SE物质对海马结构有无远期损伤作用、幼年早期SE后采用地西泮干预治疗，对海马结构有无长期的脑保护作用，以及它能否有预防大脑易损结构的远期损伤效应，即预防海马硬化的发生，一直是人们比较关注的一些问题，但迄今尚未见到有关这方面的报道。为探讨地西泮干预治疗幼年长时间反复痫性发作对成熟后大脑海马结构有何影响，本实验采用氯化锂一匹罗卡品致SE幼鼠模型，并设立地西泮干预治疗组和生理盐水对照组，之后持续追踪幼鼠发育至成鼠阶段，再经常规病理及Nissl氏染色观察海马结构的形态学改变，并应用Timm组织化学染色法进行苔藓纤维发芽方面的观察，以探讨幼鼠早期SE后采用地西泮干预治疗对大脑易损结构的远期影响作用。
1材料与方法
1.1实验动物分组 健康生后20～25 d Wistar雄性幼鼠36只（购自兰州大学医学院实验动物中心），体重42～54 g。随机分成3大组，生理盐水对照组、地西泮干预治疗组和SE组，每组12只。每大组中用于光镜检查、尼氏染色检查各3只，Timm组织化学染色6只。按组别分别处理后的幼鼠一直喂养至成鼠阶段（120d）。
1.2动物模型制作
1.2.1试剂来源及批号：氯化锂：Sjgma化学公司；匹罗卡品：Sigma化学公司；硫化钠：天津市天大化学试剂厂（批号：911125）；阿拉伯树胶粉：徐州化学试剂二厂（批号：9812012，进口分装）：1，4对苯二酚：山东单县有机化工厂（批号：9310）；硝酸银：北京化工厂。
1.2.2动物模型制作及分组①药物性SE组：腹腔注射（ip）氯化锂（：3 mol·L-1·kg-1）18～20h后，给予匹罗卡品ip（30 mg·kg-1，匹罗卡品购于Sigma化学公司）。给药约1530 min后幼鼠出现反复强直一阵挛发作，形成SE[3]。②生理盐水对照组：以相同液体量的生理盐水取代匹罗卡品，其余用药步骤及方法同SE组。③地西泮干预组：在给予匹罗卡品30 min之前给予地西泮（4mg·kg-1，ip），目的是不引起痫性发作，干预匹罗卡品的致痫作用。各组幼鼠饲养给予正常饲料喂养，自由进食，室温22～24℃。亮/暗周期12早/12晚。
1.3标本制备及检测方法与指标
1.3.1各组动物均在成鼠期采用灌流固定处死方法以0.1 g/L水合氯醛ip深麻醉后，开胸暴露心脏，12号注射针头刺入左心室尖部。切开右心耳，0. 4%硫化钠缓冲液及4%多聚甲醛灌注、取脑，4%多聚甲醛后固定，置30%蔗糖4℃过夜。30 um厚冰冻切片，每只动物取二套（各4张）切片分别行Neo-Timm及Nissl染色。
1.3.2Neo-Timm染色暗室中将晾干切片浸入新鲜配制的孵育液（50%阿拉伯胶60 ml，柠檬酸缓冲液10 ml，5.6%氢醒30ml，17%硝酸银1.5ml），置26℃水浴箱孵育40～50min，倾去孵育液，流水冲冼15～20min，脱水，中性树胶封片。光镜下行齿状回内分子层Timm银染苔藓纤维出芽评分。评分标准[3]：0表示未见Ti二颗粒；1表示偶见Timm颗粒不连续分布；2表示较多Timm颗粒不连续分布；3表示Timm颗粒近连续分布；4表示Timm颗粒连续分布；5表示Timm颗粒形成致密的层状带。
1.3.3Nissl染色切片晾干后，放入经预热至500 C的1%甲苯胺兰染色20s ，镜下观察背景呈白色或无色，如染色过深，将切片浸入95%酒精中分色镜下监视至满意效果，脱水、封片。镜下观察并半定量评价CAI、CA3，齿状日、门区及杏仁核、梨状皮层神经细胞丢失程度。
1.4统计学处理内分子层Timm评分比较采用均数士标准差（x±s）表示，利用SPSS for window 11.0统计学软件包进行方差分析、多组均数的两两比较和等级相关分析。以P<0. 05表示差异有显著意义。
2结果
2.1氯化锂一匹罗卡品致SE幼鼠行为观察生理盐水组幼鼠无任何抽搐发作迹象；地西泮干预组幼鼠亦无任何抽搐发作，个别动物仅出现兴奋表现；SE组幼鼠，最初均表现为躁动、搔抓、“洗脸样活动”、面部抽搐、单肢阵挛、湿狗样抖动和平衡失调，之后很快表现肢体强直阵挛伴站立及前肢阵挛，进一步发展达到V级，即全身强直一阵挛发作伴站立、跌倒，呈SE。在幼鼠发育至成鼠阶段，没有对大鼠再进行抽搐行为方面的观察。 2.2神经元损伤Nissl染色显示，对照组、地西泮干预级大鼠CA3，CAI区及齿状分别见大量致密的锥体细胞及颗粒细胞，门区有中等量神经元，排列整齐，形态完整，胞浆内尼氏小体丰富。匹罗卡品实验组，齿状回门区、CAI和CA3区见部分细胞形态不完整，部分细胞肿胀、破裂，细胞轮廓模糊、界限不清，排列紊乱，细胞间距加大，胞浆尼氏小体减少；齿状回颗粒细胞边界不整齐、增宽，排列松散、紊乱，呈现颗粒细胞发散改变；在门区、齿状回分子层、CAI区始层及幅射层出现反应性胶质细胞增多。神经元损伤还涉及到杏仁核、梨状皮层等边缘结构及大脑皮层。
2.3 Tim组织化学染色法观察苔藓纤维发芽SE组的大鼠与生理盐水组、地西泮干预组相比CA3区可见明显的苔藓纤维发芽见图2～4，各组Timm评分结果见表1。生理盐水对照组评分0分7张、1分5张；匹罗卡品实验组评分I分4张、2分5张、3分3张；安定干预组0分6张、1分5张、2分1张。各组数据进行两两比较等级相关分析，结果表明SE组CA3区Timm评分明显高于其它两组，具有统计学意义。而生理盐水组与地西泮干预组相比无统计学差异。在齿状回区，3组几乎都少见有Timm染色颗粒，评分结果见表1，生理盐水组0分10只，1分2只；地西泮干预组0分7只，1分5只；SE组0分6只，1分6只。各组数据进行两两等级相关分析，无统计学差异。
3讨论
Fuerst等[5]观察的结果显示，从海马结构损伤到海马硬化的形成过程可能是一种逐渐进展的情况，患者的痫性发作越早、痫性发作的病程越长，海马硬化的程度越严重。因此，生命早期的一次性长时间抽搐造成的海马结构损伤过程可能是长久的。本实验观察到大部分的SE幼鼠发育至成鼠后，仍然可见到CAI区、CA3区和齿状回有许多神经元发生变性和坏死，说明这些幼鼠致痫后海马结构易损区的损伤性改变一直持续到成鼠阶段。
本实验观察到地西泮干预组的幼鼠发育至成鼠后，不论在光镜还是Nissl染色观察，海马结构未见到任何的损伤性改变，与生理盐水对照组基本相同，说明地西泮及时控制痫性发作，早期干预控制痫性发作具有脑保护作用。在苔藓纤维发芽评分方面亦显示出没有超过3分的标本，提示在生命早期尽早控制痫性发作对减少发育成熟后苔藓纤维发芽和神经突触重组方面具有明显的预防和保护作用，控制了生命早期痫性发作的严重程度，能够减轻或消除海马结构的远期损伤效应。地西泮干预组幼鼠采用的致痫物质同样是匹罗卡品，经追踪至成鼠阶段后对海马结构观察未见有长期的损害作用；说明SE大鼠海马结构损伤性改变是痫性发作本身造成的，而匹罗卡品药物本身对海马结构损伤的可能性不大，因为地西泮干预治疗组的幼鼠几乎没有痫性发作，但匹罗卡品的用量与致痫组相同。
本实验观察到的另一种现象是，一少部分SE幼鼠发育至成鼠后并没有发现海马结构的损伤性改变，CA3区也没有苔藓纤维发芽迹象。说明同等实验背景条件下生命早期的脑损伤事件不一定都能引起海马结构的远期损伤效应，存在着个体差异。这种差异是环境因素所致还是与个体的抵抗能力有关，以及是否遗传因素参与致病过程，还需要不断积累更多的实验资料来进一步加以说明[7]。生命早期一次性长时间抽搐能否引起海马结构的长远期损伤改变是有个体化的，必须不断地意识到生命早期的反复痫性发作对一些易感个体可以产生明显的海马结构易损区的神经元脱失以及神经纤维发芽现象，而且这种损伤性改变能够持续到个体的发育成熟阶段。但如何识别哪些是易受损伤的个体，仍是我们今后需要不断探索和研究的目标，尤其是在基因组工程方面。
参考文献
[1]Liu Z，Mikaiti M，Holmes GL. Mesial temporal sclerosis：pathogenesisand significance[J].Pedi a tr Neurol，2001，12：5
[2]高旭光，吕晓明，刘芳，等.氯化锂一匹罗卡品致痈幼鼠海马结构损伤的形态学及苔藓纤维发芽研究[J].新疆预防医学杂志，2002，19（1）：23
[3]Erdtmann2Vourliotis M，Riechert U，Mayer P，et al.Pentylenetetrazole（PTZ）一induced cfos expression in the hippocampus ofkindled rats is suppressed by concomitant treatment with naloxone[B].Brain Res，1998，792：299
[4]Liu Z，Yang Y， Silveria DC，e t al .Consequence of recurrent seizuresduring early brain development [J].Neuroscience，1990，92：1443
[5]Fuerst D，Shah J，Kupsky WJ，et al.VolumetricdMRI，pathological，and neuropsychological progression in hippocampalsclerosis[J].Neurology，2001，57：184
[6]Wenzel HJ，Born DE，Dubach MF，e t al .Morphological consequencesof temporal lobe seizures in immature monkey[J].Epilepsia，1999，40（Suppl 7）：80
[7]Sutula TP，Hermann B. Progression in mesial temporal lobeepilepsy[J].Ann Nearol，1999，45：553
（收稿日期2013-02-19）（编辑张耀华）