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摘要：目的 采用不同方法对维药破布木果基因组DNA进行提取，为破布木果基因组DNA的研究提供参考。方法 采用改良CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法和改良SDS（十二烷基磺酸钠）法提取破布木果基因组DNA，并采用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳技术检测提取DNA的纯度和浓度。结果 分光光度法检测结果表明，用改良CTAB法提取的基因组DNA纯度优于改良SDS法，无蛋白质和RNA污染。琼脂糖凝胶电泳结果表明，2种方法提取得到的基因组DNA电泳图谱均有明显的主带出现，但改良SDS法提取的基因组DNA降解较多。结论 改良CTAB法可以提取相对较高质量的破布木果基因组DNA。
关键词：破布木果；基因组DNA提取；CTAB法；SDS法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.025
中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0091-03
Abstract：Objective To extract high quality genomic DNA of Cordia dicholoma seeds by using different methods；To provide references for researches on genomic DNA of Cordia dicholoma seeds. Methods Genomic DNA of Cordia dicholoma seeds was extracted through improved CTAB method and improved SDS method. Purity and concentration of obtained DNA were detected by spectrophotometry and agarose gel electrophoresis. Results The results of spectrophotometry showed that the purity of genomic DNA obtained through improved CTAB method was better than improved SDS method. Genomic DNA extracted through improved CTAB method was without protein and RNA pollution. The results of agarose gel electrophoresis showed that electrophoresis of genomic DNA obtained through the two methods both had the main belt. However， genomic DNA extracted through improved SDS method degraded more than improved CTAB method. Conclusion Improved CTAB method can obtain relatively high quality genomic DNA of Cordia dicholoma seeds.
Key words：Cordia dicholoma seeds；extraction of genomic DNA；CTAB method；SDS method
维药破布木果为紫草科Boraginaceae植物破布木Cordia dicholoma Forst.f.的干燥成熟果实，是现代维吾尔医常用药，具有降血压作用，为维药制剂祖卡木颗粒的组方药物之一[1-2]。目前已有破布木果化学成分的提取研究[3-4]，但从种质特性入手研究破布木果遗传多样性尚未见报道。
分子生物学研究的前提是DNA提取，但不同植物组织的组分各异，提取DNA的难易程度不同。破布木果为干燥果实，其化学成分主要为多糖、植醇及其他次生代谢物质。干药材不同于新鲜的动植物药材，其干燥、加工、贮藏等过程均可造成DNA不同程度降解，因此，破布木果所含DNA有所降解，且其含有的黏液质、多糖和色素等次生代谢物质使高质量基因组DNA提取较为困难，需要采用合适的提取方法才能得到符合要求的DNA。常用的植物DNA提取方法主要有CTAB （十六烷基三乙基溴化铵）法和SDS（十二烷基磺酸钠）法[5]。因此，本研究在传统CTAB法和SDS法的基础上，参考文献[5-9]对2种方法加以改进，并用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法对这2种方法的提取效果进行比较，旨在探索找到一种简便、快捷而又经济的高质量破布木果基因组DNA提取方法，为破布木果的分子生物学研究奠定基础。
1 仪器与试药
WD-9413B型凝胶成像分析仪（北京市六一仪器厂），GL-88B型漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），TG16-W型微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），JD1000-2型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司），DK-8D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司），多用途水平电泳仪（北京百晶生物技术有限公司），K5500 Micro-Spectrophotometer（北京凯奥科技发展有限公司）。
改良的2×CTAB提取缓冲液：2%CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.02 mol/L EDTA（pH 8.0）、0.1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）、0.2%β-巯基乙醇、10%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
改良SDS提取液：4%SDS、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）、0.5 mol/L NaCl、4%PVP、0.5%β-巯基乙醇。 3 mol/L醋酸钠、氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）、苯酚-氯仿（1∶1，V/V）、无水乙醇为分析纯，TE缓冲液。
破布木果购于新疆麦迪森维药有限公司饮片厂，经新疆自治区中医医院李永和主任药师鉴定为破布木Cordia dicholoma Forst.f.的干燥成熟果实。
2 方法与结果
2.1 破布木果基因组DNA提取
2.1.1 改良CTAB法 参照文献[9]方法改良。①取样品0.15 g，在预冷的研钵中捣碎，加入1 mL研磨液，迅速研磨成糊状；②均匀移入3个1.5 mL离心管中，加入2×CTAB提取液200 μL，混匀，65 ℃水浴保温1 h，每隔10 min震荡1次；③在4 ℃条件下，12 000 r /min 离心10 min，吸取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）抽提3次，10 000 r/min离心5 min；④取上清液，加2/3体积的无水乙醇，混匀后-20 ℃放置1 h沉淀，4 ℃、10 000 r/min离心5 min；⑤弃上清液，得到DNA絮状沉淀；⑥沉淀物用80%乙醇和无水乙醇分别漂洗2次，室温晾干，加50 μL TE缓冲液溶解，4 ℃保存备用。
2.1.2 改良SDS法 参考文献[5]方法改良。①取样品0.15 g，在预冷的研钵中捣碎，加入1 mL研磨液，迅速研磨成糊状；②均匀移入3个1.5 mL离心管中，加入SDS提取液200 μL，混匀，65 ℃水浴保温30 min，每隔10 min震荡1次；③4 ℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，加入等体积的苯酚-氯仿（1∶1，V/V）抽提3次，12 000 r/min离心5 min；④吸取上清液，加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，4 ℃、12 000 r/min离心5 min；⑤弃上清液，得到DNA絮状沉淀；⑥用体积分数为80%的乙醇清洗DNA 2次，自然干燥后，加50 μL TE缓冲液溶解DNA，4 ℃保存备用。
2.2 破布木果DNA吸光度检测
分别取2种方法所得破布木果DNA样品液1 μL，在紫外分光光度计260、280 nm波长处测定吸光值，计算OD260/OD280比值，判断DNA纯度，结果见表1。可见，2种方法均能得到一定量的DNA。改良SDS法提取的破布木果基因组DNA样品浓度较高，但是其OD260/OD280值<1.6[10]，说明样品中有蛋白质污染，DNA纯度较差。而改良CTAB法提取的破布木果基因组DNA样品的OD260/OD280>1.8[11]，说明DNA纯度较好，可以作为分子生物学进一步研究的对象。
2.3 破布木果DNA电泳检测
分别取5 μL破布木果基因DNA样品液，点于1.0%琼脂糖凝胶中电泳（电压130 V，电流300 A）25 min，溴化乙锭染色30 min，凝胶成像扫描保存，结果见图1。可以看出，2种方法提取的总DNA均在同一位置有一主条带，但所提取总DNA效果有所差异。改良CTAB法提取破布木果基因组DNA电泳后出现一条主带，条带相对较暗，而改良SDS法提取的总DNA电泳图谱也出现一条明显主条带，条带相对较亮。可能是由于DNA浓度影响了条带的亮度。
此外，从电泳图谱中可以看出，2种方法的点样孔无明显发亮，说明样品中已基本除去多糖及其他一些次生代谢物质。2种方法所提取的DNA都有所降解，改良SDS法提取的总DNA降解较明显。本研究所采用的药材为干药材，自身会降解，对结果有一定的影响。
3 讨论
本研究采用改良CTAB法和改良SDS法提取维药破布木果基因组DNA。CTAB和SDS是去污剂，既能溶解细胞膜，又能较好地去除多糖的干扰[12]。紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳结果分析表明，改良SDS法提取的基因组DNA纯度较差，有蛋白质污染，并且DNA降解较明显。改良CTAB法提取基因组DNA纯度较好，降解相对较少，可以为破布木果分子生物学的进一步研究提供较高质量的DNA。
对于植物的DNA提取而言，充分研磨可破碎细胞壁和细胞膜，使DNA释放到提取缓冲液中。在提取破布木果基因组DNA时，选择提取液作为研磨液，不仅可以节约成本，而且提取液中含有β-巯基乙醇和PVP。β-巯基乙醇可以有效降低细胞的氧化损伤；PVP则可与醇、酚类物质结合形成螯合物，通过离心分离出去，从而减少褐变；提取液也可以钝化组织破碎时DNA酶的活性，保护DNA，避免DNA降解。研磨成糊状时，应迅速转移至离心管中，防止药材粘在研钵底部。
沉淀后的DNA要充分洗涤，每次洗涤轻弹离心管后，再静置数分钟，以使小分子杂质更充分溶于洗涤液中。除去洗涤液时，尽量不要碰触到DNA沉淀，以避免DNA断裂成小片段。采用TE溶解DNA沉淀，干燥方式最好选择空气干燥。
参考文献：
[1] 冯书晓，陈文，江发寿.维药祖卡木颗粒中挥发油β-环糊精包合工艺研究[J].中成药，2006，28（11）：1674-1676.
[2] 王宇真，吕风民，韩勇明.维吾尔医药资源及药物学说简介[J].中国中药杂志，2005，30（4）：316-317.
[3] 刘枫，张雪佳，李洁，等.破布木果总多酚的超声提取工艺研究[J].环球中医药，2013，6（8）：580-584.
[4] Shuge Tian， Feng Liu， Xuejia Zhang， et al. Phytochemical composition and antioxidant capacity of Cordia dicholoma seeds[J]. Pak J Pharm，2014，27（5）：1123-1129.
[5] 胡祎晨，孙正海，王锦，等.4种滑叶铁线莲基因组DNA提取方法比较[J].安徽农业科学，2011，39（36）：22215-22216.
[6] 王淼，谭莹，张丽华.中药材贝母DNA不同提取方法的比较[J].吉林林学院学报，2011，12（6）：662-665.
[7] 龚伯奇，罗桂花，王伟.贝母鉴别方法研究进展[J].安徽农业科学， 2009，37（4）：1603-1604.
[8] 郝岗平，边高鹏，张媛英.泰山白花丹参干叶片高质量DNA的提取[J].中草药，2006，37（6）：855-857.
[9] 杨丽，张俊环，孙浩元，等.基于改良SDS法的杏基因组DNA提取[J].中国农学通报，2008，24（4）：69-71.
[10] 吴忠兰，宋玉霞，马洪爱，等.用改进的CTAB法提取肉苁蓉基因组DNA[J].宁夏大学学报：自然科学版，2008，29（1）：78-80.
[11] 余志熊，欧高政，陈清西，等.火龙果总DNA提取方法比较[J].中国农业通报，2010，26（4）：300-303.
[12] 徐彦军，刘洋.苦瓜DNA提取方法的比较[J].湖北农业科学，2012， 51（17）：3866-3868.
（收稿日期：2014-09-28；编辑：陈静）
关键词：破布木果；基因组DNA提取；CTAB法；SDS法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.025
中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）05-0091-03
Abstract：Objective To extract high quality genomic DNA of Cordia dicholoma seeds by using different methods；To provide references for researches on genomic DNA of Cordia dicholoma seeds. Methods Genomic DNA of Cordia dicholoma seeds was extracted through improved CTAB method and improved SDS method. Purity and concentration of obtained DNA were detected by spectrophotometry and agarose gel electrophoresis. Results The results of spectrophotometry showed that the purity of genomic DNA obtained through improved CTAB method was better than improved SDS method. Genomic DNA extracted through improved CTAB method was without protein and RNA pollution. The results of agarose gel electrophoresis showed that electrophoresis of genomic DNA obtained through the two methods both had the main belt. However， genomic DNA extracted through improved SDS method degraded more than improved CTAB method. Conclusion Improved CTAB method can obtain relatively high quality genomic DNA of Cordia dicholoma seeds.
Key words：Cordia dicholoma seeds；extraction of genomic DNA；CTAB method；SDS method
维药破布木果为紫草科Boraginaceae植物破布木Cordia dicholoma Forst.f.的干燥成熟果实，是现代维吾尔医常用药，具有降血压作用，为维药制剂祖卡木颗粒的组方药物之一[1-2]。目前已有破布木果化学成分的提取研究[3-4]，但从种质特性入手研究破布木果遗传多样性尚未见报道。
分子生物学研究的前提是DNA提取，但不同植物组织的组分各异，提取DNA的难易程度不同。破布木果为干燥果实，其化学成分主要为多糖、植醇及其他次生代谢物质。干药材不同于新鲜的动植物药材，其干燥、加工、贮藏等过程均可造成DNA不同程度降解，因此，破布木果所含DNA有所降解，且其含有的黏液质、多糖和色素等次生代谢物质使高质量基因组DNA提取较为困难，需要采用合适的提取方法才能得到符合要求的DNA。常用的植物DNA提取方法主要有CTAB （十六烷基三乙基溴化铵）法和SDS（十二烷基磺酸钠）法[5]。因此，本研究在传统CTAB法和SDS法的基础上，参考文献[5-9]对2种方法加以改进，并用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法对这2种方法的提取效果进行比较，旨在探索找到一种简便、快捷而又经济的高质量破布木果基因组DNA提取方法，为破布木果的分子生物学研究奠定基础。
1 仪器与试药
WD-9413B型凝胶成像分析仪（北京市六一仪器厂），GL-88B型漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），TG16-W型微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），JD1000-2型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司），DK-8D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司），多用途水平电泳仪（北京百晶生物技术有限公司），K5500 Micro-Spectrophotometer（北京凯奥科技发展有限公司）。
改良的2×CTAB提取缓冲液：2%CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.02 mol/L EDTA（pH 8.0）、0.1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）、0.2%β-巯基乙醇、10%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
改良SDS提取液：4%SDS、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）、0.5 mol/L NaCl、4%PVP、0.5%β-巯基乙醇。 3 mol/L醋酸钠、氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）、苯酚-氯仿（1∶1，V/V）、无水乙醇为分析纯，TE缓冲液。
破布木果购于新疆麦迪森维药有限公司饮片厂，经新疆自治区中医医院李永和主任药师鉴定为破布木Cordia dicholoma Forst.f.的干燥成熟果实。
2 方法与结果
2.1 破布木果基因组DNA提取
2.1.1 改良CTAB法 参照文献[9]方法改良。①取样品0.15 g，在预冷的研钵中捣碎，加入1 mL研磨液，迅速研磨成糊状；②均匀移入3个1.5 mL离心管中，加入2×CTAB提取液200 μL，混匀，65 ℃水浴保温1 h，每隔10 min震荡1次；③在4 ℃条件下，12 000 r /min 离心10 min，吸取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）抽提3次，10 000 r/min离心5 min；④取上清液，加2/3体积的无水乙醇，混匀后-20 ℃放置1 h沉淀，4 ℃、10 000 r/min离心5 min；⑤弃上清液，得到DNA絮状沉淀；⑥沉淀物用80%乙醇和无水乙醇分别漂洗2次，室温晾干，加50 μL TE缓冲液溶解，4 ℃保存备用。
2.1.2 改良SDS法 参考文献[5]方法改良。①取样品0.15 g，在预冷的研钵中捣碎，加入1 mL研磨液，迅速研磨成糊状；②均匀移入3个1.5 mL离心管中，加入SDS提取液200 μL，混匀，65 ℃水浴保温30 min，每隔10 min震荡1次；③4 ℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，加入等体积的苯酚-氯仿（1∶1，V/V）抽提3次，12 000 r/min离心5 min；④吸取上清液，加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，4 ℃、12 000 r/min离心5 min；⑤弃上清液，得到DNA絮状沉淀；⑥用体积分数为80%的乙醇清洗DNA 2次，自然干燥后，加50 μL TE缓冲液溶解DNA，4 ℃保存备用。
2.2 破布木果DNA吸光度检测
分别取2种方法所得破布木果DNA样品液1 μL，在紫外分光光度计260、280 nm波长处测定吸光值，计算OD260/OD280比值，判断DNA纯度，结果见表1。可见，2种方法均能得到一定量的DNA。改良SDS法提取的破布木果基因组DNA样品浓度较高，但是其OD260/OD280值<1.6[10]，说明样品中有蛋白质污染，DNA纯度较差。而改良CTAB法提取的破布木果基因组DNA样品的OD260/OD280>1.8[11]，说明DNA纯度较好，可以作为分子生物学进一步研究的对象。
2.3 破布木果DNA电泳检测
分别取5 μL破布木果基因DNA样品液，点于1.0%琼脂糖凝胶中电泳（电压130 V，电流300 A）25 min，溴化乙锭染色30 min，凝胶成像扫描保存，结果见图1。可以看出，2种方法提取的总DNA均在同一位置有一主条带，但所提取总DNA效果有所差异。改良CTAB法提取破布木果基因组DNA电泳后出现一条主带，条带相对较暗，而改良SDS法提取的总DNA电泳图谱也出现一条明显主条带，条带相对较亮。可能是由于DNA浓度影响了条带的亮度。
此外，从电泳图谱中可以看出，2种方法的点样孔无明显发亮，说明样品中已基本除去多糖及其他一些次生代谢物质。2种方法所提取的DNA都有所降解，改良SDS法提取的总DNA降解较明显。本研究所采用的药材为干药材，自身会降解，对结果有一定的影响。
3 讨论
本研究采用改良CTAB法和改良SDS法提取维药破布木果基因组DNA。CTAB和SDS是去污剂，既能溶解细胞膜，又能较好地去除多糖的干扰[12]。紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳结果分析表明，改良SDS法提取的基因组DNA纯度较差，有蛋白质污染，并且DNA降解较明显。改良CTAB法提取基因组DNA纯度较好，降解相对较少，可以为破布木果分子生物学的进一步研究提供较高质量的DNA。
对于植物的DNA提取而言，充分研磨可破碎细胞壁和细胞膜，使DNA释放到提取缓冲液中。在提取破布木果基因组DNA时，选择提取液作为研磨液，不仅可以节约成本，而且提取液中含有β-巯基乙醇和PVP。β-巯基乙醇可以有效降低细胞的氧化损伤；PVP则可与醇、酚类物质结合形成螯合物，通过离心分离出去，从而减少褐变；提取液也可以钝化组织破碎时DNA酶的活性，保护DNA，避免DNA降解。研磨成糊状时，应迅速转移至离心管中，防止药材粘在研钵底部。
沉淀后的DNA要充分洗涤，每次洗涤轻弹离心管后，再静置数分钟，以使小分子杂质更充分溶于洗涤液中。除去洗涤液时，尽量不要碰触到DNA沉淀，以避免DNA断裂成小片段。采用TE溶解DNA沉淀，干燥方式最好选择空气干燥。
参考文献：
[1] 冯书晓，陈文，江发寿.维药祖卡木颗粒中挥发油β-环糊精包合工艺研究[J].中成药，2006，28（11）：1674-1676.
[2] 王宇真，吕风民，韩勇明.维吾尔医药资源及药物学说简介[J].中国中药杂志，2005，30（4）：316-317.
[3] 刘枫，张雪佳，李洁，等.破布木果总多酚的超声提取工艺研究[J].环球中医药，2013，6（8）：580-584.
[4] Shuge Tian， Feng Liu， Xuejia Zhang， et al. Phytochemical composition and antioxidant capacity of Cordia dicholoma seeds[J]. Pak J Pharm，2014，27（5）：1123-1129.
[5] 胡祎晨，孙正海，王锦，等.4种滑叶铁线莲基因组DNA提取方法比较[J].安徽农业科学，2011，39（36）：22215-22216.
[6] 王淼，谭莹，张丽华.中药材贝母DNA不同提取方法的比较[J].吉林林学院学报，2011，12（6）：662-665.
[7] 龚伯奇，罗桂花，王伟.贝母鉴别方法研究进展[J].安徽农业科学， 2009，37（4）：1603-1604.
[8] 郝岗平，边高鹏，张媛英.泰山白花丹参干叶片高质量DNA的提取[J].中草药，2006，37（6）：855-857.
[9] 杨丽，张俊环，孙浩元，等.基于改良SDS法的杏基因组DNA提取[J].中国农学通报，2008，24（4）：69-71.
[10] 吴忠兰，宋玉霞，马洪爱，等.用改进的CTAB法提取肉苁蓉基因组DNA[J].宁夏大学学报：自然科学版，2008，29（1）：78-80.
[11] 余志熊，欧高政，陈清西，等.火龙果总DNA提取方法比较[J].中国农业通报，2010，26（4）：300-303.
[12] 徐彦军，刘洋.苦瓜DNA提取方法的比较[J].湖北农业科学，2012， 51（17）：3866-3868.
（收稿日期：2014-09-28；编辑：陈静）