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【摘要】 目的 羊型布鲁氏菌属于人畜共患病菌，通过克隆分析外膜蛋白omp31-2基因，学习基因的克隆方法和序列比对分析方法。方法 通过提取布鲁氏杆菌基因组，用PCR的方法扩增omp31-2基因并连接到克隆载体上测序比对。结果 本实验成功克隆出omp31-2基因并构建了pMD19T-omp31-2克隆载体。结论 通过本次学习，了解并掌握了引物设计，基因扩增和序列比对分析等分子生物学技术试验方法。
【关键词】 外膜蛋白omp31-2；PCR（聚合酶链式反应）；蓝白斑筛选
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.09.735 文章编号：1004-7484（2013）-09-5390-02
1 研究背景
布氏杆菌病又称布鲁氏菌病（brucellosis）又称地中海弛张热，马尔他热，波浪热或波状热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病，其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等。布鲁氏菌病属于动物原性传染病，常见于牛、野牛、猪、绵羊、山羊、狗及鹿等动物当中。布鲁氏菌病在世界各地也有出现，特别在毗邻地中海的欧洲及北非洲国家、东非、西亚、中亚、印度、墨西哥和中南美洲等国家尤为常见。我国内蒙古地区也较为常见。山羊和绵羊对羊种布氏杆菌最易感。病畜和带菌动物，特别是流产母畜是最危险的传染源。病菌存在于流产的胎儿、胎衣、羊水及阴道分泌物中。病畜乳汁或精液中也有病菌存在。人类可以感染布鲁氏菌。布氏杆菌病的潜伏期由几天至几个月不等，病发时会出现类似感冒的病征，包括发热、畏寒、出汗、头痛、背痛、虚弱、体重下降及食欲不振等[1]。布鲁氏菌病也可引起反覆性发热、关节痛和疲倦等慢性病征。布鲁氏菌是世界范围内引起人畜共患病的重要病原体之一。为此，构建omp31原核重组质粒，寻找有效蛋白抗原，用于布鲁氏菌抗原的诊断[2]。同时为亚单位疫苗的研制提供必备的物质基础[3]。
2 研究目的
学习羊型布鲁氏菌外膜蛋白omp31-2的克隆和测序，对其序列进行比对研究，为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的基础。为早期快速诊断做出贡献。
3 技术路线
培养羊型布鲁氏菌—→提取细菌的基因组DNA—→PCR扩增基因omp31-2—→连接到克隆载体pMD19-TVector上—→将载体转化到感受态细胞中—→进行蓝白斑筛选—→挑取白斑进行克隆培养—→基因测序—→序列比对。
6.4 测序结果及分析 由于信号衰减，只测通672bp。Genbank中BLAST分析。本次测序结果比已公布的omp31-2的cds少了52个碱基，这可能是与测序公司在进行测序时，测试信号衰减有关，丢到了一部分的序列信息。
结果可以看出所测得的基因序列从第1位碱基开始到第672位碱基可与Genbank中的已知序列FJ654488.1的第52位碱基到723位碱基比对上。
7 结论
本次实验成功构建了pMD19T-omp31-2克隆重组质粒，并对该基因进行了测序比对分析，学习掌握了PCR的引物设计，基因的克隆和利用Genbank的BLAST进行序列比对分析等分子生物学实验方法。
参考文献
[1] 徐丽楠.布鲁氏菌病流行病学在我国的发展趋势及监测[J].中外医疗，2009，（16）：177.
[2] 陈瑶，李明.布鲁杆菌外膜蛋白OMP31和bp26基因的克隆、表达及鉴定[J].中外医疗，2006，25（3）：277-280.
[3] [美]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，黃培堂，等.译.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2002.597-701.
【关键词】 外膜蛋白omp31-2；PCR（聚合酶链式反应）；蓝白斑筛选
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.09.735 文章编号：1004-7484（2013）-09-5390-02
1 研究背景
布氏杆菌病又称布鲁氏菌病（brucellosis）又称地中海弛张热，马尔他热，波浪热或波状热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病，其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等。布鲁氏菌病属于动物原性传染病，常见于牛、野牛、猪、绵羊、山羊、狗及鹿等动物当中。布鲁氏菌病在世界各地也有出现，特别在毗邻地中海的欧洲及北非洲国家、东非、西亚、中亚、印度、墨西哥和中南美洲等国家尤为常见。我国内蒙古地区也较为常见。山羊和绵羊对羊种布氏杆菌最易感。病畜和带菌动物，特别是流产母畜是最危险的传染源。病菌存在于流产的胎儿、胎衣、羊水及阴道分泌物中。病畜乳汁或精液中也有病菌存在。人类可以感染布鲁氏菌。布氏杆菌病的潜伏期由几天至几个月不等，病发时会出现类似感冒的病征，包括发热、畏寒、出汗、头痛、背痛、虚弱、体重下降及食欲不振等[1]。布鲁氏菌病也可引起反覆性发热、关节痛和疲倦等慢性病征。布鲁氏菌是世界范围内引起人畜共患病的重要病原体之一。为此，构建omp31原核重组质粒，寻找有效蛋白抗原，用于布鲁氏菌抗原的诊断[2]。同时为亚单位疫苗的研制提供必备的物质基础[3]。
2 研究目的
学习羊型布鲁氏菌外膜蛋白omp31-2的克隆和测序，对其序列进行比对研究，为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的基础。为早期快速诊断做出贡献。
3 技术路线
培养羊型布鲁氏菌—→提取细菌的基因组DNA—→PCR扩增基因omp31-2—→连接到克隆载体pMD19-TVector上—→将载体转化到感受态细胞中—→进行蓝白斑筛选—→挑取白斑进行克隆培养—→基因测序—→序列比对。
6.4 测序结果及分析 由于信号衰减，只测通672bp。Genbank中BLAST分析。本次测序结果比已公布的omp31-2的cds少了52个碱基，这可能是与测序公司在进行测序时，测试信号衰减有关，丢到了一部分的序列信息。
结果可以看出所测得的基因序列从第1位碱基开始到第672位碱基可与Genbank中的已知序列FJ654488.1的第52位碱基到723位碱基比对上。
7 结论
本次实验成功构建了pMD19T-omp31-2克隆重组质粒，并对该基因进行了测序比对分析，学习掌握了PCR的引物设计，基因的克隆和利用Genbank的BLAST进行序列比对分析等分子生物学实验方法。
参考文献
[1] 徐丽楠.布鲁氏菌病流行病学在我国的发展趋势及监测[J].中外医疗，2009，（16）：177.
[2] 陈瑶，李明.布鲁杆菌外膜蛋白OMP31和bp26基因的克隆、表达及鉴定[J].中外医疗，2006，25（3）：277-280.
[3] [美]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，黃培堂，等.译.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2002.597-701.