论文部分内容阅读
摘要：目的 对比不同分析方法对清喉咽合剂中连翘苷含量的影响。方法 采用高效液相色谱法（HPLC）和三波长-分光光度计对清喉咽合剂中连翘苷进行含量测定。结果 连翘苷在0.025 1～0.125 6 mg/mL范围内，分别在波长278.5、248.0、272.4 nm处测定吸收度时，ΔA与浓度C之间呈现较好的线性关系，回归方程为ΔA=89.705C-0.041，r=0.999 7；平均加样回收率为97.48%，RSD=1.88%。三波长测定法与HPLC测定结果比较，差异无统计学意义。结论 三波长测定法对供试品制备要求简单，操作简便易行，试验的重复性好，效率高，可以作为该制剂组分含量测定方法。
关键词：三波长-分光光度法；高效液相色谱法；清喉咽合剂；连翘苷
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.025
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）03-0065-02
连翘为清热解毒药，归肺、心、小肠经，其主要功效为清热解毒、消肿散结、疏散风热，临床上用于痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒、风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦渴、神昏发斑、热淋涩痛等[1]。在中药制剂中使用较为广泛，主要含有木脂素类（如连翘苷、连翘苷元、连翘酯苷A等）、黄酮类（如芸香苷等）、三萜类（如齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸等）。由于木脂素类化合物热稳定性较差，故在制剂生产过程中很有可能受热分解，故本研究选择清喉咽合剂作为考察对象，对制剂中的连翘苷进行定量评价分析，以对含有此类的中药制剂生产提供参考。
1 仪器与试药
岛津LC2010CHT型高效液相色谱仪（四元泵、在线脱气、自动冷却装置、全自动进样器、紫外检测器），UV-2401PC型紫外可见分光光度计（日本岛津），梅特勒-托利多AB135-S双量程电子天平（瑞士），AS10200ADT型超声波清洗器。
清喉咽合剂（中国人民解放军第155医院院内制剂，批号20110725、20110408、20111108），连翘苷对照品（科翔生物科技有限公司，批号08-2011，经检测纯度大于98%）；色谱甲醇（山东禹王实业有限公司化工分公司，批号20110103061），双重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2 溶液制备
2.1 供试品溶液的制备
精密吸取清喉咽合剂2 mL至100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，再精密取5 mL至10 mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释至刻度，即得。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取经110 ℃干燥至恒重的连翘苷对照品3.14 mg，置25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.125 6 mg/mL的连翘苷对照品溶液。
2.3 阴性对照溶液的制备
取与清喉咽合剂处方药材比例相同的中药饮片适量，连翘除外，粉碎过3号筛，取相当量的处方用量于容量瓶中，加入甲醇，按照供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
3 三波长测定及方法学考察
3.1 三波长的确定
清喉咽合剂中连翘苷的最大吸收波长为278.50 nm，而在此波长处，提取液的其他组分对其有干扰。根据三波长分光光度法测定原理，采用1 cm石英比色皿在波长200～800 nm范围内扫描，绘制供试品、对照品、阴性对照吸收曲线（见图1），采用作图法和计算法确定3个测定波长。
如图1所示，选取连翘苷最大吸收波长278.5 nm为λ1，阴性对照溶液吸收波长248.0 nm为λ2，按作图法粗略找到使阴性干扰的ΔA值为0的λ3为273 nm。按公式ΔA=A2-[（λ3-λ2）A1+（λ2-λ1）A3]/[（λ3-λ2）+（λ2-λ1）][2]，求得使干扰组分ΔA值为0的A3对应的波长λ3，见表1。可知精选λ3为272.4 nm。
3.2 标准曲线的绘制
精密量取0.125 6 mg/mL的连翘苷对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于5 mL容量瓶中，加入甲醇使其溶解，摇匀，放至室温，定容，即得。再分别在278.5、248.0、272.4 nm波长处测定吸收度，并扣除甲醇溶液空白，以ΔA和浓度C进行回归计算，得回归方程ΔA=89.705C-0.041，相关系数r=0.999 7，可见，在0.025 1～0.125 6 mg/mL范围内，连翘苷浓度与ΔA有良好的线性关系，可按标准曲线法进行定量分析。
3.3 稳定性试验
按“2.1”项下方法制备供试品溶液并进行稳定性试验，结果表明，样品放置12 h以上，测得其吸光度值不变，表明该供试品溶液在12 h内成分稳定。
3.4 重复性试验
取供试品溶液5份，按上述方法重复测定连翘苷含量，结果表明，连翘苷含量为0.072 6 mg/mL，RSD=1.37%，本方法重复性良好。
3.5 加样回收率试验
精密吸取清喉咽合剂1 mL于200 mL容量瓶中，再精密加入连翘苷对照品溶液适量，按“2.1”项下方法制备供试品溶液9份，根据所确定的测定条件，在该波长下测定供试品吸收度，求得其相关参数。结果见表2。
3.6 样品含量测定
取3个批号的清喉咽合剂，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在选定的3个波长处测定其吸收度，每个批号平行3份，根据绘制的标准曲线计算连翘苷的含量。按照2010年版《中华人民共和国药典》清喉咽合剂项下高效液相色谱（HPLC）含量测定方法进行定量分析。结果见表3。经配对检验，t=1.804（n=9），P=0.093，差异无统计学意义。
4 讨论
连翘苷属于木脂素类化合物，其结构母核中含有内酯环，在热碱性溶液中容易开环发生分解，对光线较为敏感，长时间照射会改变其化学结构，因此，在含有连翘的中药制剂生产过程中，很容易被破坏分解掉，在实际生产中应特别注意热不稳定类成分的提取。在对该制剂进行含量测定中发现，市售的某些制剂中，连翘苷几乎损失殆尽，甚至无法对其进行准确定量。
在对连翘苷进行三波长定量分析时，考虑到连翘内化学成分的组成，其中香豆素类的药理作用较为明显，故采用香豆素代表性的连翘苷作为对照品进行光谱扫描及含量测定。在连翘药材中可能有同样母核的化合物较多，可能对其定量产生一定的影响，而三波长测定的方法能有效避开这一影响，使含量测定结果更加准确。在供试品制备过程中加入甲醇处理时有絮状沉淀产生，对试验结果有一定的干扰，造成回收率偏低，在改用水做溶剂处理时，沉淀较少，并且对回收率影响较低，故而采用水作为溶剂制备供试品溶液。
在光谱扫描中发现，干扰组分的最大吸收与连翘苷的最大吸收波长相近，故λ1选择了连翘苷的最大吸收波长，在选择λ2时避开干扰成分的最大吸收，选取了吸收度较为平缓的248 nm作为检测波长，经过作图法和计算法相结合寻求最佳的λ3位置，有效避开了溶液中其他成分的干扰。
HPLC首先要用色谱柱将化合物分离，再通过外标法或内标法进行定量分析；而三波长测定法是通过官能团紫外吸收的吸光度不同而进行定量。两者测定原理截然不同，但通过对比分析可以看出，二者测定结果差异無统计学意义。且三波长测定法较HPLC更节约成本及溶剂，操作更为简便，故建议选用三波长法进行定量分析。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：159-160.
[2] 石磊，张振巍.二次回归正交设计法优选黄芩苷醇提工艺[J].中药材， 2011，34（12）：141-145.
（收稿日期：2012-08-10，编辑：陈静）
关键词：三波长-分光光度法；高效液相色谱法；清喉咽合剂；连翘苷
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.025
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）03-0065-02
连翘为清热解毒药，归肺、心、小肠经，其主要功效为清热解毒、消肿散结、疏散风热，临床上用于痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒、风热感冒、温病初起、温热入营、高热烦渴、神昏发斑、热淋涩痛等[1]。在中药制剂中使用较为广泛，主要含有木脂素类（如连翘苷、连翘苷元、连翘酯苷A等）、黄酮类（如芸香苷等）、三萜类（如齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸等）。由于木脂素类化合物热稳定性较差，故在制剂生产过程中很有可能受热分解，故本研究选择清喉咽合剂作为考察对象，对制剂中的连翘苷进行定量评价分析，以对含有此类的中药制剂生产提供参考。
1 仪器与试药
岛津LC2010CHT型高效液相色谱仪（四元泵、在线脱气、自动冷却装置、全自动进样器、紫外检测器），UV-2401PC型紫外可见分光光度计（日本岛津），梅特勒-托利多AB135-S双量程电子天平（瑞士），AS10200ADT型超声波清洗器。
清喉咽合剂（中国人民解放军第155医院院内制剂，批号20110725、20110408、20111108），连翘苷对照品（科翔生物科技有限公司，批号08-2011，经检测纯度大于98%）；色谱甲醇（山东禹王实业有限公司化工分公司，批号20110103061），双重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2 溶液制备
2.1 供试品溶液的制备
精密吸取清喉咽合剂2 mL至100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，再精密取5 mL至10 mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释至刻度，即得。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取经110 ℃干燥至恒重的连翘苷对照品3.14 mg，置25 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.125 6 mg/mL的连翘苷对照品溶液。
2.3 阴性对照溶液的制备
取与清喉咽合剂处方药材比例相同的中药饮片适量，连翘除外，粉碎过3号筛，取相当量的处方用量于容量瓶中，加入甲醇，按照供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
3 三波长测定及方法学考察
3.1 三波长的确定
清喉咽合剂中连翘苷的最大吸收波长为278.50 nm，而在此波长处，提取液的其他组分对其有干扰。根据三波长分光光度法测定原理，采用1 cm石英比色皿在波长200～800 nm范围内扫描，绘制供试品、对照品、阴性对照吸收曲线（见图1），采用作图法和计算法确定3个测定波长。
如图1所示，选取连翘苷最大吸收波长278.5 nm为λ1，阴性对照溶液吸收波长248.0 nm为λ2，按作图法粗略找到使阴性干扰的ΔA值为0的λ3为273 nm。按公式ΔA=A2-[（λ3-λ2）A1+（λ2-λ1）A3]/[（λ3-λ2）+（λ2-λ1）][2]，求得使干扰组分ΔA值为0的A3对应的波长λ3，见表1。可知精选λ3为272.4 nm。
3.2 标准曲线的绘制
精密量取0.125 6 mg/mL的连翘苷对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于5 mL容量瓶中，加入甲醇使其溶解，摇匀，放至室温，定容，即得。再分别在278.5、248.0、272.4 nm波长处测定吸收度，并扣除甲醇溶液空白，以ΔA和浓度C进行回归计算，得回归方程ΔA=89.705C-0.041，相关系数r=0.999 7，可见，在0.025 1～0.125 6 mg/mL范围内，连翘苷浓度与ΔA有良好的线性关系，可按标准曲线法进行定量分析。
3.3 稳定性试验
按“2.1”项下方法制备供试品溶液并进行稳定性试验，结果表明，样品放置12 h以上，测得其吸光度值不变，表明该供试品溶液在12 h内成分稳定。
3.4 重复性试验
取供试品溶液5份，按上述方法重复测定连翘苷含量，结果表明，连翘苷含量为0.072 6 mg/mL，RSD=1.37%，本方法重复性良好。
3.5 加样回收率试验
精密吸取清喉咽合剂1 mL于200 mL容量瓶中，再精密加入连翘苷对照品溶液适量，按“2.1”项下方法制备供试品溶液9份，根据所确定的测定条件，在该波长下测定供试品吸收度，求得其相关参数。结果见表2。
3.6 样品含量测定
取3个批号的清喉咽合剂，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在选定的3个波长处测定其吸收度，每个批号平行3份，根据绘制的标准曲线计算连翘苷的含量。按照2010年版《中华人民共和国药典》清喉咽合剂项下高效液相色谱（HPLC）含量测定方法进行定量分析。结果见表3。经配对检验，t=1.804（n=9），P=0.093，差异无统计学意义。
4 讨论
连翘苷属于木脂素类化合物，其结构母核中含有内酯环，在热碱性溶液中容易开环发生分解，对光线较为敏感，长时间照射会改变其化学结构，因此，在含有连翘的中药制剂生产过程中，很容易被破坏分解掉，在实际生产中应特别注意热不稳定类成分的提取。在对该制剂进行含量测定中发现，市售的某些制剂中，连翘苷几乎损失殆尽，甚至无法对其进行准确定量。
在对连翘苷进行三波长定量分析时，考虑到连翘内化学成分的组成，其中香豆素类的药理作用较为明显，故采用香豆素代表性的连翘苷作为对照品进行光谱扫描及含量测定。在连翘药材中可能有同样母核的化合物较多，可能对其定量产生一定的影响，而三波长测定的方法能有效避开这一影响，使含量测定结果更加准确。在供试品制备过程中加入甲醇处理时有絮状沉淀产生，对试验结果有一定的干扰，造成回收率偏低，在改用水做溶剂处理时，沉淀较少，并且对回收率影响较低，故而采用水作为溶剂制备供试品溶液。
在光谱扫描中发现，干扰组分的最大吸收与连翘苷的最大吸收波长相近，故λ1选择了连翘苷的最大吸收波长，在选择λ2时避开干扰成分的最大吸收，选取了吸收度较为平缓的248 nm作为检测波长，经过作图法和计算法相结合寻求最佳的λ3位置，有效避开了溶液中其他成分的干扰。
HPLC首先要用色谱柱将化合物分离，再通过外标法或内标法进行定量分析；而三波长测定法是通过官能团紫外吸收的吸光度不同而进行定量。两者测定原理截然不同，但通过对比分析可以看出，二者测定结果差异無统计学意义。且三波长测定法较HPLC更节约成本及溶剂，操作更为简便，故建议选用三波长法进行定量分析。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：159-160.
[2] 石磊，张振巍.二次回归正交设计法优选黄芩苷醇提工艺[J].中药材， 2011，34（12）：141-145.
（收稿日期：2012-08-10，编辑：陈静）