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[摘要] 目的 探讨丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒的制备及其工艺优化。 方法 采用乳化溶剂蒸发法制备丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒；考察单因素在纳米粒制备过程中的影响，包括TSⅡA载药纳米粒中的药物浓度、乳化剂浓度、有机相/外水相、超声时间和强度等的改变；并通过正交设计优化TSⅡA多级靶向纳米粒的制备工艺。 结果 本实验成功制备了含RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒，优选工艺参数为：药物浓度1mg/mL，载体材料浓度20mg/mL，有机相/外水相为1∶10，超声强度和时间分别为200W，20×5s。 结论 此丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒的制备工艺切实可行。所制备的TNP包封率和载药量较高，为丹参酮ⅡA的临床应用提供了更广阔的前景。
[关键词] 丹参酮ⅡA；载药纳米粒；RGD；肿瘤靶向
[中图分类号] TQ461 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）03-09-04
丹参酮ⅡA（Tashinone ⅡA，TSⅡA）为传统中药丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）中的有效脂溶性成分。近年来研究表明，TSⅡA对多种肿瘤细胞均有明显的细胞毒作用[1-2]，但因丹参酮ⅡA难溶于水、体内代谢快、生物利用率低等缺点，限制其在临床上的广泛应用。课题组前期研究发现丹参酮ⅡA聚乳酸载药纳米粒（TSⅡA-PLA NPs）对肝癌有较好疗效[3-5]。本研究采用乳化溶剂蒸发法，制备含
RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒（TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD NPs），可以增加药物半衰期，延长药物在体内的作用时间，同时显著提高对肿瘤的靶向作用。
1 仪器与材料
1.1 试剂
丹参酮ⅡA对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110766-200417，纯度99.3%）；Poloxamer188（德国BASF公司）；mPEG-PLGA-PLL、mPEG-PLGA-PLL-cRGD（上海市肿瘤研究所段友容课题组提供）；吉非罗齐（中国药品生物制品检定所，批号：100284-199801）；甲醇为色谱醇；其他试剂为分析纯。
1.2 主要仪器
激光粒度散射仪（Nicomp 380/ZLS，美国）；紫外分光光度计（德国Eppendorf公司）；微量电子分析天平（Sartotius CP225D）； Centrifuge 5804R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；质谱仪（API 3000，美国ABI公司）；XW-80A 型旋涡混合仪（上海医科大学仪器厂）。
2 实验方法
2.1 丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒制备
将含RGD修饰的空白纳米粒溶解于TSⅡA二氯甲烷溶液（0.8mg/mL）中，取mPEG-PLGA-PLL-cRGD（浓度20mg/mL）200μL，加入0.5%的乳化剂F-68的水溶液10mL，进行超声乳化。随后将制备的纳米粒溶液置入烧杯中，搅拌挥发有机溶剂，即得丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒[6]。
2.2 药物浓度测定方法
2.2.1 HPLC检测的色谱条件 色谱柱为Zorbax XDB-C18（150mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-水（85︰15），流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为270nm，进样量为20μL。
2.2.2 标准曲线的建立 精密称取TSⅡA 5mg，置250mL的量瓶中，加无水乙醇溶解并定容，作为丹参酮对照品储备液。分别精密量取一定量的对照品储备液稀释，得浓度为0.001，0.01，0.1，0.5，1，2，5，8，10，20μg /mL的标准溶液，HPLC测定。标准曲线由浓度（Concentration）对峰面积（Peak area）做线性回归所得。
2.2.3 单因素考察 改变载药纳米粒中的药物浓度，载体浓度，乳化剂浓度，有机相与外水相体积比，超声强度和超声时间等条件，制备丹参酮ⅡA多级靶向载药纳米粒，考察单因素对载药纳米粒的影响，筛选出较优的工艺参数。
2.2.4 正交实验 根据2.2.3实验结果，选择对载药纳米粒粒径大小、包封率、载药量影响较大的四个因素，分别为：药物/材料，乳化剂F-68浓度，有机相与外水相体积比和超声次数，每个因素3个水平进行正交实验设计。综合评价各因素的影响，确定最佳的载药纳米粒的处方和工艺。
3 结果
3.1 绘制标准曲线
标准曲线以药物浓度（Concentration）对峰面积（Peak area）做线性回归，见图1。
3.2 单因素考察
3.2.1 药物浓度 在实验中如选用较低的TSⅡA药物浓度时，载药纳米粒包封率会比较高，但载药量会随之降低，而选用较高的TSⅡA药物浓度时载药纳米粒的包封率又会随之降低。综合实验结果，我们选择的最佳TSⅡA浓度为1mg/mL。
3.2.2 载体材料浓度 其他条件相同时，如想提高包封率，可增加载体材料的浓度，使平均分配到每个载药纳米粒载体上的药物减少。在本实验中，我们选择的载体浓度是20mg/mL。见表1。
3.2.3 有机相/外水相体积比（O/W） O/W体积比能够影响载药纳米粒的粒径，O/W减少，纳米粒的粒径会增大，O/W增大，纳米粒的粒径会减小。综合本实验的数据，选择较合适的O/W为1︰10。
3.2.4 超声时间 超声时间对粒径大小和包封率影响不大，本实验中选择的超声时间为20×5s。
3.2.5 超声强度 选择适当的超声强度在制备载药纳米粒的过程中非常重要，超声强度过大容易导致载药纳米粒被破坏；功率太小又会导致载药纳米粒粒径较大且分散不均匀。综合本实验中所制备的TSⅡA载药纳米粒包封率及载药量等各项数据，选择超声强度为200W。 3.3 正交设计优化制备工艺
由正交实验结果可见：以包封率为指标的最佳工艺为A2B2C2D1，影响的显著性为D>C>B>A，其中D药物-材料比例具有显著性影响；以载药量为指标的最佳工艺为A2B1C2D2，影响的显著性为C>D>B>A，影响无显著性。由于D1和
D2水平时载药量结果相差不大，但包封率的结果相差很大，并且该因素对于包封率具有显著性影响，因此选择D1；B1和B2水平时载药量的结果相差不大，包封率的结果相差也不大，但对于包封率的影响大于载药量，因此选择D2。而因此确定最佳工艺为A2B2C2D1，即mPEG-PLGA-PLL 20mg，加0.8mg/ml的丹参酮二氯甲烷溶液1mL溶解，加10mL 0.5% F-68溶液，冷水浴超声（200W）40s×10次，室温搅拌除去二氯甲烷，8000r/min×5min离心除沉淀，即得纳米粒水分散体。见表2。
4 讨论
目前在临床上对肿瘤的药物治疗想达到的效果主要是使肿瘤局部的药物浓度尽可能达到最大化，以期达到增效减毒的作用。随着对纳米技术的运用，有学者发现纳米粒包裹药物制备成载药纳米粒后，药物具有较好的靶向作用，可以使药物在肿瘤中得到蓄积，因此得到了广泛关注。研究发现通过纳米载体包裹制备的新型药物剂型，有如下的一些优点和特性：（1）提高药物的生物利用度[7-8]；（2）增强药物的肿瘤靶向性[9-10]；纳米粒径的改变可使药物到达体内不同的部位，并使药物在肝脏和肿瘤中得到蓄积；（3）具有较好的控（缓）释性，载药纳米粒在进入体内后，药物可以从纳米材料中释缓慢释放出来，避免了“暴释效应”[11-12]。另外，载药纳米粒可以有效的增加药物半衰期，延长药物的作用时间，与游离药物相比抗肿瘤效果得到进一步提高 [13-15]。
本实验采用乳化溶剂蒸发法制备含RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒，该制备方法操作简便，稳定性好，并有较好的可重复性。优选工艺参数为：药物浓度1mg/mL，载体材料浓度20mg/mL，O/W为1∶10，超声强度和时间分别为200W， 20×5s。
[参考文献]
[1] Lin C，Wang L，Wang H，et al. Tanshinone IIA inhibits breast cancer stem cells growth in vitro and in vivo through attenuation of IL-6/STAT3/NF-kB signaling pathways[J]. J Cell Biochem，2013，114（9）：2061-2070.
[2] 王炎，李琦，范忠泽，等.丹参酮ⅡA介导p38MAPK信号转导诱导人肝癌细胞凋亡[J].世界华人消化杂志， 2009， 17（2）：124-129.
[3] Li Q，Wang Y，Feng N，et al.Novel polymeric nanoparticles containing tanshinone IIA for the treatment of hepatoma[J].J Drug Target，2008，16（10）：725-732.
[4] 王炎，李琦，冯年平，等.丹参酮ⅡA纳米粒治疗小鼠肝癌及其对Cyclin E表达的影响[J].上海中医药杂志， 2007，41（9）：74-77.
[5] 李琦，王炎，范忠泽，等.丹参酮ⅡA及其纳米粒诱导肝癌细胞凋亡及对p38MAPK、TGFβ1信号蛋白表达的影响[J].肿瘤，2008，28（1）：8-12.
[6] Yin P，Wang Y，Qiu Y，Hou L，et al. Bufalin-loaded mPEG-PLGA-PLL-cRGD nanoparticles：preparation， cellular uptake，tissue distribution，and anticancer activity[J].Int J Nanomedicine，2012，7：3961-3969.
[7] Kushwaha AK，Vuddanda PR，Karunanidhi P，et al.Development and evaluation of solid lipid nanoparticles of raloxifene hydrochloride for enhanced bioavailability[J].Biomed Res Int，2013，2013：584549.
[8] Veeranarayanan S，Poulose AC，Mohamed MS，et al. Synthesis and application of luminescent single CdS quantum dot encapsulated silica nanoparticles directed for precision optical bioimaging[J].Int J Nanomedicine，2012，7：3769-3786.
[9] Morales-Avila E，Ferro-Flores G，Ocampo-García BE，et al. Engineered multifunctional RGD-gold nanoparticles for the detection of tumour-specific alpha（v）beta（3） expression：chemical characterisation and ecotoxicological risk assessment[J].J Biomed Nanotechnol，2012，8（6）：991-999. [10] Kotagiri N，Lee JS，Kim JW. Selective pathogen targeting and macrophage evading carbon nanotubes through dextran sulfate coating and PEGylation for photothermal theranostics[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（6）：1008-1016.
[11] Liang X，Sun Y，Liu L，et al. Folate-functionalized nanoparticles for controlled ergosta-4，6，8（14），22-tetraen-3-one delivery[J].Int J Pharm，2013，441（1-2）：1-8.
[12] Yang S，Li N，Chen D，et al. A facile way to prepare magnetic nanoparticles encapsulated by targetable pH-sensitive copolymer for controlled drug release[J].J Control Release，2013，172（1）：e66-67.
[13] Díaz MR，Vivas-Mejia PE.Nanoparticles as Drug Delivery Systems in Cancer Medicine：Emphasis on RNAi-Containing Nanoliposomes[J].Pharmaceuticals （Basel），2013，6（11）：1361-1380.
[14] Ma L，Kohli M，Smith A. Nanoparticles for combination drug therapy[J].ACS Nano，2013，7（11）：9518-9525.
[15] Jia X，Yin J，He D，et al. Polyacrylic acid modified upconversion nanoparticles for simultaneous pH-triggered drug delivery and release imaging[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（12）：2063-2072.
（收稿日期：2013-12-11）
[关键词] 丹参酮ⅡA；载药纳米粒；RGD；肿瘤靶向
[中图分类号] TQ461 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）03-09-04
丹参酮ⅡA（Tashinone ⅡA，TSⅡA）为传统中药丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）中的有效脂溶性成分。近年来研究表明，TSⅡA对多种肿瘤细胞均有明显的细胞毒作用[1-2]，但因丹参酮ⅡA难溶于水、体内代谢快、生物利用率低等缺点，限制其在临床上的广泛应用。课题组前期研究发现丹参酮ⅡA聚乳酸载药纳米粒（TSⅡA-PLA NPs）对肝癌有较好疗效[3-5]。本研究采用乳化溶剂蒸发法，制备含
RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒（TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD NPs），可以增加药物半衰期，延长药物在体内的作用时间，同时显著提高对肿瘤的靶向作用。
1 仪器与材料
1.1 试剂
丹参酮ⅡA对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110766-200417，纯度99.3%）；Poloxamer188（德国BASF公司）；mPEG-PLGA-PLL、mPEG-PLGA-PLL-cRGD（上海市肿瘤研究所段友容课题组提供）；吉非罗齐（中国药品生物制品检定所，批号：100284-199801）；甲醇为色谱醇；其他试剂为分析纯。
1.2 主要仪器
激光粒度散射仪（Nicomp 380/ZLS，美国）；紫外分光光度计（德国Eppendorf公司）；微量电子分析天平（Sartotius CP225D）； Centrifuge 5804R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；质谱仪（API 3000，美国ABI公司）；XW-80A 型旋涡混合仪（上海医科大学仪器厂）。
2 实验方法
2.1 丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒制备
将含RGD修饰的空白纳米粒溶解于TSⅡA二氯甲烷溶液（0.8mg/mL）中，取mPEG-PLGA-PLL-cRGD（浓度20mg/mL）200μL，加入0.5%的乳化剂F-68的水溶液10mL，进行超声乳化。随后将制备的纳米粒溶液置入烧杯中，搅拌挥发有机溶剂，即得丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒[6]。
2.2 药物浓度测定方法
2.2.1 HPLC检测的色谱条件 色谱柱为Zorbax XDB-C18（150mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-水（85︰15），流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为270nm，进样量为20μL。
2.2.2 标准曲线的建立 精密称取TSⅡA 5mg，置250mL的量瓶中，加无水乙醇溶解并定容，作为丹参酮对照品储备液。分别精密量取一定量的对照品储备液稀释，得浓度为0.001，0.01，0.1，0.5，1，2，5，8，10，20μg /mL的标准溶液，HPLC测定。标准曲线由浓度（Concentration）对峰面积（Peak area）做线性回归所得。
2.2.3 单因素考察 改变载药纳米粒中的药物浓度，载体浓度，乳化剂浓度，有机相与外水相体积比，超声强度和超声时间等条件，制备丹参酮ⅡA多级靶向载药纳米粒，考察单因素对载药纳米粒的影响，筛选出较优的工艺参数。
2.2.4 正交实验 根据2.2.3实验结果，选择对载药纳米粒粒径大小、包封率、载药量影响较大的四个因素，分别为：药物/材料，乳化剂F-68浓度，有机相与外水相体积比和超声次数，每个因素3个水平进行正交实验设计。综合评价各因素的影响，确定最佳的载药纳米粒的处方和工艺。
3 结果
3.1 绘制标准曲线
标准曲线以药物浓度（Concentration）对峰面积（Peak area）做线性回归，见图1。
3.2 单因素考察
3.2.1 药物浓度 在实验中如选用较低的TSⅡA药物浓度时，载药纳米粒包封率会比较高，但载药量会随之降低，而选用较高的TSⅡA药物浓度时载药纳米粒的包封率又会随之降低。综合实验结果，我们选择的最佳TSⅡA浓度为1mg/mL。
3.2.2 载体材料浓度 其他条件相同时，如想提高包封率，可增加载体材料的浓度，使平均分配到每个载药纳米粒载体上的药物减少。在本实验中，我们选择的载体浓度是20mg/mL。见表1。
3.2.3 有机相/外水相体积比（O/W） O/W体积比能够影响载药纳米粒的粒径，O/W减少，纳米粒的粒径会增大，O/W增大，纳米粒的粒径会减小。综合本实验的数据，选择较合适的O/W为1︰10。
3.2.4 超声时间 超声时间对粒径大小和包封率影响不大，本实验中选择的超声时间为20×5s。
3.2.5 超声强度 选择适当的超声强度在制备载药纳米粒的过程中非常重要，超声强度过大容易导致载药纳米粒被破坏；功率太小又会导致载药纳米粒粒径较大且分散不均匀。综合本实验中所制备的TSⅡA载药纳米粒包封率及载药量等各项数据，选择超声强度为200W。 3.3 正交设计优化制备工艺
由正交实验结果可见：以包封率为指标的最佳工艺为A2B2C2D1，影响的显著性为D>C>B>A，其中D药物-材料比例具有显著性影响；以载药量为指标的最佳工艺为A2B1C2D2，影响的显著性为C>D>B>A，影响无显著性。由于D1和
D2水平时载药量结果相差不大，但包封率的结果相差很大，并且该因素对于包封率具有显著性影响，因此选择D1；B1和B2水平时载药量的结果相差不大，包封率的结果相差也不大，但对于包封率的影响大于载药量，因此选择D2。而因此确定最佳工艺为A2B2C2D1，即mPEG-PLGA-PLL 20mg，加0.8mg/ml的丹参酮二氯甲烷溶液1mL溶解，加10mL 0.5% F-68溶液，冷水浴超声（200W）40s×10次，室温搅拌除去二氯甲烷，8000r/min×5min离心除沉淀，即得纳米粒水分散体。见表2。
4 讨论
目前在临床上对肿瘤的药物治疗想达到的效果主要是使肿瘤局部的药物浓度尽可能达到最大化，以期达到增效减毒的作用。随着对纳米技术的运用，有学者发现纳米粒包裹药物制备成载药纳米粒后，药物具有较好的靶向作用，可以使药物在肿瘤中得到蓄积，因此得到了广泛关注。研究发现通过纳米载体包裹制备的新型药物剂型，有如下的一些优点和特性：（1）提高药物的生物利用度[7-8]；（2）增强药物的肿瘤靶向性[9-10]；纳米粒径的改变可使药物到达体内不同的部位，并使药物在肝脏和肿瘤中得到蓄积；（3）具有较好的控（缓）释性，载药纳米粒在进入体内后，药物可以从纳米材料中释缓慢释放出来，避免了“暴释效应”[11-12]。另外，载药纳米粒可以有效的增加药物半衰期，延长药物的作用时间，与游离药物相比抗肿瘤效果得到进一步提高 [13-15]。
本实验采用乳化溶剂蒸发法制备含RGD修饰的丹参酮ⅡA多级靶向纳米粒，该制备方法操作简便，稳定性好，并有较好的可重复性。优选工艺参数为：药物浓度1mg/mL，载体材料浓度20mg/mL，O/W为1∶10，超声强度和时间分别为200W， 20×5s。
[参考文献]
[1] Lin C，Wang L，Wang H，et al. Tanshinone IIA inhibits breast cancer stem cells growth in vitro and in vivo through attenuation of IL-6/STAT3/NF-kB signaling pathways[J]. J Cell Biochem，2013，114（9）：2061-2070.
[2] 王炎，李琦，范忠泽，等.丹参酮ⅡA介导p38MAPK信号转导诱导人肝癌细胞凋亡[J].世界华人消化杂志， 2009， 17（2）：124-129.
[3] Li Q，Wang Y，Feng N，et al.Novel polymeric nanoparticles containing tanshinone IIA for the treatment of hepatoma[J].J Drug Target，2008，16（10）：725-732.
[4] 王炎，李琦，冯年平，等.丹参酮ⅡA纳米粒治疗小鼠肝癌及其对Cyclin E表达的影响[J].上海中医药杂志， 2007，41（9）：74-77.
[5] 李琦，王炎，范忠泽，等.丹参酮ⅡA及其纳米粒诱导肝癌细胞凋亡及对p38MAPK、TGFβ1信号蛋白表达的影响[J].肿瘤，2008，28（1）：8-12.
[6] Yin P，Wang Y，Qiu Y，Hou L，et al. Bufalin-loaded mPEG-PLGA-PLL-cRGD nanoparticles：preparation， cellular uptake，tissue distribution，and anticancer activity[J].Int J Nanomedicine，2012，7：3961-3969.
[7] Kushwaha AK，Vuddanda PR，Karunanidhi P，et al.Development and evaluation of solid lipid nanoparticles of raloxifene hydrochloride for enhanced bioavailability[J].Biomed Res Int，2013，2013：584549.
[8] Veeranarayanan S，Poulose AC，Mohamed MS，et al. Synthesis and application of luminescent single CdS quantum dot encapsulated silica nanoparticles directed for precision optical bioimaging[J].Int J Nanomedicine，2012，7：3769-3786.
[9] Morales-Avila E，Ferro-Flores G，Ocampo-García BE，et al. Engineered multifunctional RGD-gold nanoparticles for the detection of tumour-specific alpha（v）beta（3） expression：chemical characterisation and ecotoxicological risk assessment[J].J Biomed Nanotechnol，2012，8（6）：991-999. [10] Kotagiri N，Lee JS，Kim JW. Selective pathogen targeting and macrophage evading carbon nanotubes through dextran sulfate coating and PEGylation for photothermal theranostics[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（6）：1008-1016.
[11] Liang X，Sun Y，Liu L，et al. Folate-functionalized nanoparticles for controlled ergosta-4，6，8（14），22-tetraen-3-one delivery[J].Int J Pharm，2013，441（1-2）：1-8.
[12] Yang S，Li N，Chen D，et al. A facile way to prepare magnetic nanoparticles encapsulated by targetable pH-sensitive copolymer for controlled drug release[J].J Control Release，2013，172（1）：e66-67.
[13] Díaz MR，Vivas-Mejia PE.Nanoparticles as Drug Delivery Systems in Cancer Medicine：Emphasis on RNAi-Containing Nanoliposomes[J].Pharmaceuticals （Basel），2013，6（11）：1361-1380.
[14] Ma L，Kohli M，Smith A. Nanoparticles for combination drug therapy[J].ACS Nano，2013，7（11）：9518-9525.
[15] Jia X，Yin J，He D，et al. Polyacrylic acid modified upconversion nanoparticles for simultaneous pH-triggered drug delivery and release imaging[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（12）：2063-2072.
（收稿日期：2013-12-11）