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[摘要] 目的 研究壮筋续骨汤对大鼠股骨骨折后血清碱性成纤维细胞因子（bFGF）和转化生长因子（TGFβ1）水平以及骨折愈合的影响。 方法 成年健康雄性Wistar大鼠72只，应用电锯在股骨中段切断股骨制备骨折动物模型，壮筋续骨汤水煎液灌胃干预治疗。大体解剖观察骨折局部的愈合情况，组织病理学观察骨痂结构，酶联免疫吸附试验检测血清bFGF和TGFβ1水平。 结果 解剖观察发现，骨折后7d骨折断端主要为肉芽组织，14d为纤维性骨痂，21d可见骨性骨痂，模型组与治疗组未见显著差异，28d治疗组骨痂重塑质量明显优于模型组。大鼠血清bFGF和TGFβ1水平，模型组与治疗组在骨折后7、14、21d无显著差异，在28d治疗组明显高于模型组。 结论 壮筋续骨汤可能在骨折愈合后期通过维持血清bFGF和TGFβ1的水平、增强其活性、减缓其降解而促进骨折愈合。
[关键词] 壮筋续骨汤；骨折；bFGF；TGFβ1；大鼠
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）03-27-04
骨折重塑修复是一个极其复杂的病理生理过程，现代医学以复位、固定、功能锻炼等物理治疗手段为主。从20世纪80年代才开始对影响骨折愈合的生物因子进行研究[1]，近几年成骨诱导研究成为热点，并已进入临床实验和应用阶段[2]。骨折后局部坏死的骨细胞、成骨细胞和被吸收的骨基质均可向骨折周围释放生长因子[3]。在众多细胞因子中，
碱性成纤维细胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）[4]和转化生长因子（transforming growth factor，TGFβ1）[5]的作用尤为突出。中医药治疗骨折有其独特优势，许多中药活性成分有促进骨折愈合、修复和改建作用，黄培军等[6-7]研究发现，壮筋续骨汤联合内固定疗法治疗骨折均可获得较单纯内固定更好疗效，但其作用机制仍然不甚清楚。本实验试图观察壮筋续骨汤对大鼠股骨骨折后血清bFGF和TGFβ1水平影响及其对骨折愈合促进作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
成年健康雄性清洁级Wistar大鼠72只，年龄3个月，体重230～250g，购自青岛市药物检验所动物中心：SCXK（鲁）20120010。将动物适应性饲养7d，然后随机分为对照组24只、模型组24只、治疗组24只。
1.2 制备骨折模型[8]
应用10%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg）麻醉动物，俯卧固定，碘酒消毒，经股外侧切口，分离股前、外侧肌间隔直至股骨，在股骨中段（大转子下1cm）用低速牙科钻（JBX-NE22，NSK Co. Ltd. Japan）锯断股骨，应用克氏针（直径1mm）髓腔逆行固定，然后逐层缝合，喷洒青霉素注射液，无菌包扎切口，手术成功率100%。对照组动物不切断股骨，然后逐层缝合切口，无菌包扎切口。术后即刻拍摄X线片，然后将动物放置笼中，每笼1只，单独饲养。
1.3 治疗方法
壮筋续骨汤（出自清代医学家赵濂所著《伤科大成》）由壮筋续骨丹演化而来，依据《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发〔2009〕3号）制备[9]。每副中药充分煎煮两次，最终药液为224mL，含生药112g，浓度0.5g/mL。根据前期研究结果证实，每日1.25g/kg（2.5ml/kg）较为理想[9]。本实验以1.25g/kg（2.5ml/kg）定量喂养，每日1次，连续28d。对照组和模型组同步给予等量的生理盐水。
1.4 评价指标
治疗后7、14、21、28d，每组各取6只动物观察应用一下方法观察研究。
1.4.1 大体观察 治疗结束后，在相应时间点大鼠应用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，完整取出股骨，生理盐水洗涤残存血迹，照相记录骨折愈合情况。
1.4.2 组织病理 将股骨置4%多聚甲醛中固定24h，蒸馏水浸泡4h，再置于20%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脱钙15d。然后截取骨折处上、下1.0cm部位的组织（包括血肿、骨痂组织），常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，应用切片机（Leica2015，上海）沿股骨纵轴切片，厚5μm，贴于载玻片。苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察骨痂的组织结构。
1.4.3 酶联免疫吸附试验（ELISA） 动物麻醉后，经腹主动脉取血（4mL），普通离心机4000转/min离心10min，分离血清（2mL）。采用双抗夹心ELISA试剂盒（Blue Green公司）测定大鼠血清bFGF和TGFβ1的水平。按试剂盒说明书操作，向特异性抗体包被酶标板中每孔加血清标本100μL，37℃孵育2h，双蒸水洗涤5min×3次，加显色剂显色2min，双蒸水洗涤5min×3次，洗板机拍干，用酶标仪（Bio-Rad 550型，美国）在450nm测定每孔的吸光度值，根据样品的吸光度值在制备标准曲线坐标上找出对应的bFGF和TGFβ1浓度（ng/L）。
1.5 统计学处理
应用SPSS11.0统计软件处理，计量资料以（）表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大体解剖观察
对照组大鼠骨皮质完整（图1A），模型组大鼠骨折线清晰（图1F），骨折7d（图1B）骨折断端被纤维性肉芽组织包围（针扎易透），至14d（图1C）纤维性骨痂形成、变硬（针扎有阻力），至21d（图1D）纤维性骨痂和软骨骨痂增多、中心硬度增大（针扎阻力增大），至28d（图1E）纤维性骨痂逐渐被软骨和骨性骨痂代替，硬度增大（针扎不透）。治疗组大鼠术后7～21d（图1G、H、I）骨痂结构与模型组相应时间点比较无明显差异，但至28d治疗组（图1J）骨痂硬度较模型组（图1E）明显增大（针扎不进）。 2.2 组织病理观察
对照组大鼠骨质结构正常（图2A），模型组大鼠在骨折当天骨折端断为血肿组织所填充（图2F），在骨折后7d（图2B）成纤维细胞自骨膜下增生长入骨折间隙，形成肉芽组织，夹杂少量成骨细胞，并有大量局部炎性细胞浸润，治疗组与模型组比较未见明显差异；至骨折14d（图2C）骨折端纤维性组
织、成骨细胞增多，形成大量纤维性骨痂及少量软骨骨痂，治疗组与模型组无明显差异；至骨折21d（图2D）破骨细胞、成骨细胞活跃，可见骨重塑腔隙、散在骨小梁形成，至28d（图2E）骨小梁清晰可见，排列规则，可见骨皮质及骨髓腔。治疗组骨架结构在7～21d（图2G、H、I）与模型组相应时间比较无显著性差异，但至28天治疗组骨细胞排列相对整齐清晰（图2J），显著优于骨折组（图2E）。
2.3 酶联免疫吸附检测
2.3.1 血清bFGF水平 在骨折后7、14、21、28d，对照组大鼠血清BMP7水平均未见显著性变化（t=0.36～1.47，P>0.05）。模型组大鼠血清bFGF水平，在骨折后7、14、21d也未见显著性变化（t=0.19～1.04，P>0.05），但均显著高于对照组（t=11.37～13.21，P<0.05），在骨折后28d显著下降（t=14.68，P<0.05）。治疗组大鼠血清bFGF水平在骨折后7、14和21d均无明显差异（t=0.38～1.60，P>0.05），骨折后28d显著下降（t=5.78，P<0.05）。但治疗组骨折后28d显著高于对照组及模型组（t=10.34～11.42，P<0.05）。见表1。
2.3.2 血清TGF-β1水平 对照组大鼠骨折后7、14、21、28d血清TGFβ1水平均未见显著性变化（t=0.09～0.84，P>0.05）。模型组大鼠血清TGFβ1水平在骨折后7、14、21d也未见显著性变化（t=0.29～0.38，P>0.05），但均显著高于对照组（t=9.02～9.93，P<0.05），在骨折后28d显著下降（t=7.54，P<0.05）。治疗组大鼠血清TGFβ1水平在骨折后7、14、21d均无明显差异（t=0.45～0.93，P>0.05），骨折后28d显著下降（t=5.78，P<0.05）。治疗组骨折后28d显著高于对照组及模型组（t=6.31～7.25，P<0.05）。见表2。
3 讨论
实验研究表明，bFGF通过调节成纤维细胞和成骨细胞的增殖、分化，并改变细胞产物的合成作用于成骨过程。bFGF不仅能促进骨细胞的生长，而且可以促进毛细血管的增生，改善局部血液供应，促进成骨细胞与支架材料的黏附[10]。Tatsuyama等[4]研究表明，在参与骨折修复过程中TGF-β1与bFGF有正协同作用，TGF-β1是bFGF的调控因子[11]。联合应用能协同刺激成骨细胞增殖，加速软骨内骨化的进程[12]。bFGF在骨折愈合各阶段有恒定的基因表达水平，一般是骨损伤初期表达强烈，达到高峰后逐渐减弱。Kawaguchi等[13]研究表明，内源性bFGF在骨折后1～3周内持续存在于骨折位点，王立平等[14]研究表明，从骨折后4d至3周内，bFGF表达强烈，随时间的推移逐渐减弱，bFGF早期表达能使骨端各种细胞分裂、增殖，使血肿机化形成肉芽组织，后期主要使间质细胞或成纤维细胞保持增殖活跃状态。
根据传统中医理论，骨折愈合过程可以分为早、中、后三期，根据辩证论者原则分别以活血化瘀、续筋接骨、滋补肝肾等方法促进骨折愈合。现代医学认为，骨折是骨的完整性和连续性中断，根据组织学和细胞学的变化，骨折愈合可分为三阶段（血肿机化、原始骨痂形成、骨痂改造塑型）[1]。国内学者应用中西医结合疗法治疗骨折取得了较好的临床疗效：黄佩军[6]应用壮筋续骨汤联合锁定加压钢板内固定治疗胫骨平台骨折有效率90%；对于肱骨骨折骨不连患者，现代医学单侧多功能外固定支架配合中药壮筋续骨汤内服，骨折愈合率高达97.4%[15]。在老年股骨粗隆间骨折的治疗中，梁士义等[16]采用动力髋螺钉固定配合壮筋续骨丹治疗，疗效满意。刘钟华等[17]应用现代药理学研究表明，丹参、川芎、红花等活血化瘀药在血肿机化期可以改善骨折断端局部血液循环，为骨痂的形成提供优越条件。周秋丽等[18]报道，在骨痂形成期续断、骨碎补参与骨折愈合过程，主要因其含有胶原、钙盐和微量元素，可促进蛋白合成代谢，有利于骨质修复。本次实验结果显示壮筋续骨汤在骨折后第1～3周内并没有提高大鼠血清中bFGF和TGFβ1水平，只是在21d后，能使骨生长因子继续保持较高水平，说明壮筋续骨汤并不能促进内源性骨生长因子分泌，在骨折愈合后期通过增强内源性因生物子活性、延长其半衰期、减缓其降解速度，维持血清bFGF和TGFβ1的水平，促进骨折愈合。
[参考文献]
[1] Croteau S， Ranch F， Silvestri A， et al. Bone morphogenetic proteins in orthopedics：from basic science to clinical Practice[J]. Orthopedics，1999，22（7）：686-695.
[2] Kwong FN，Hoyland JA，Fremont AJ，et al.Altered relative expression of BMPs and BMP inhibitors in cartilaginous areas of human fractures progressing towards nonunion[J]. Orthop Res，2009，27（6）：752-757.
[3] Schmidmaier G，Wildemann B， Heejer J， et al.Improvement of fracture healing by systemic administration of growth hormone and local application of Insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beat 1[J]. Bone，2002，31（1）：165-172. [4] Tatsuyama K，Maezawa Y，Baha H，et al.Expression of various growth factors for cell proliferation and cylodifferentiation during fracture repair of bone[J].Eur J Histochem，2000，44（3）：269-278.
[5] Blumenfeld I，Srouj S，Lanir Y，et al. Enhancement of bone defect healing in old rats by TGF-beat and IGF-1[J].Exp Gerontol，2002，37（4）：553-565.
[6] 黄佩军.壮筋续骨汤联合锁定加压钢板内固定治疗胫骨平台骨折疗效观察[J].内蒙古中医药，2012，31（14）： 20-21.
[7] 王祥杰，周缜，潘月兴，等.壮筋续骨汤促进骨折愈合的实验研究[J].临床医学工程，2012，19（1）：33-35.
[8] 王祥杰，周缜，王贯习，等.壮筋续骨汤对骨折大鼠血清BMP和NPY水平的影响[J].临床医学工程，2012，19（2）：188-190.
[9] 王祥杰，潘月兴，杜志仙，等.壮筋续骨汤对大鼠骨折骨痂中骨形态发生蛋白-7和神经肽Y表达的影响[J].中华中医药杂志，2013，28（8）：2420-2422.
[10] 刘燚， 沈海琦.碱性成纤维细胞生长因子与骨折后的组织修复重建[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（33）：6522-6525.
[11] 曾敬，徐栋梁，张惠忠，等.成骨细胞移植促进骨质疏松性骨折愈合过程中相关因子的动态表达[J].中国临床康复，2003，7（3）：448-473.
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[13] Kawaguchi H，Kurokawa T，Hanada K，et al.Stimulation of fracture repair by recombinant human basic fibroblast growth factor in normal and streptozotocin-diabetic rats[J]. Endocrinology，1994，135（2）：774-781.
[14] 王立平，党耕町.碱性成纤维细胞生长因子在骨创愈合过程中的表达与合成[J].中华骨科杂志，1999，19（5）：488-490.
[15] 张学恒，郭筱秋，曾石川，等.单侧多功能外固定支架配合中药治疗肱骨骨折骨不连43例[J].江西中医药，2006，37（8）：37-38.
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[17] 刘钟华，杨世荣，回春.中药促进骨折愈合的实验研究概况[J].长春中医学院学报，2004，20（2）：63-65.
[18] 周秋丽，王丽娟.鹿茸多肽对实验性骨折的治疗作用及机理研究[J].白求恩医科大学学报，1999，25（5）：586-588.
（收稿日期：2013-12-15）
[关键词] 壮筋续骨汤；骨折；bFGF；TGFβ1；大鼠
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）03-27-04
骨折重塑修复是一个极其复杂的病理生理过程，现代医学以复位、固定、功能锻炼等物理治疗手段为主。从20世纪80年代才开始对影响骨折愈合的生物因子进行研究[1]，近几年成骨诱导研究成为热点，并已进入临床实验和应用阶段[2]。骨折后局部坏死的骨细胞、成骨细胞和被吸收的骨基质均可向骨折周围释放生长因子[3]。在众多细胞因子中，
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1 材料与方法
1.1 实验动物分组
成年健康雄性清洁级Wistar大鼠72只，年龄3个月，体重230～250g，购自青岛市药物检验所动物中心：SCXK（鲁）20120010。将动物适应性饲养7d，然后随机分为对照组24只、模型组24只、治疗组24只。
1.2 制备骨折模型[8]
应用10%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg）麻醉动物，俯卧固定，碘酒消毒，经股外侧切口，分离股前、外侧肌间隔直至股骨，在股骨中段（大转子下1cm）用低速牙科钻（JBX-NE22，NSK Co. Ltd. Japan）锯断股骨，应用克氏针（直径1mm）髓腔逆行固定，然后逐层缝合，喷洒青霉素注射液，无菌包扎切口，手术成功率100%。对照组动物不切断股骨，然后逐层缝合切口，无菌包扎切口。术后即刻拍摄X线片，然后将动物放置笼中，每笼1只，单独饲养。
1.3 治疗方法
壮筋续骨汤（出自清代医学家赵濂所著《伤科大成》）由壮筋续骨丹演化而来，依据《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发〔2009〕3号）制备[9]。每副中药充分煎煮两次，最终药液为224mL，含生药112g，浓度0.5g/mL。根据前期研究结果证实，每日1.25g/kg（2.5ml/kg）较为理想[9]。本实验以1.25g/kg（2.5ml/kg）定量喂养，每日1次，连续28d。对照组和模型组同步给予等量的生理盐水。
1.4 评价指标
治疗后7、14、21、28d，每组各取6只动物观察应用一下方法观察研究。
1.4.1 大体观察 治疗结束后，在相应时间点大鼠应用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，完整取出股骨，生理盐水洗涤残存血迹，照相记录骨折愈合情况。
1.4.2 组织病理 将股骨置4%多聚甲醛中固定24h，蒸馏水浸泡4h，再置于20%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脱钙15d。然后截取骨折处上、下1.0cm部位的组织（包括血肿、骨痂组织），常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，应用切片机（Leica2015，上海）沿股骨纵轴切片，厚5μm，贴于载玻片。苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察骨痂的组织结构。
1.4.3 酶联免疫吸附试验（ELISA） 动物麻醉后，经腹主动脉取血（4mL），普通离心机4000转/min离心10min，分离血清（2mL）。采用双抗夹心ELISA试剂盒（Blue Green公司）测定大鼠血清bFGF和TGFβ1的水平。按试剂盒说明书操作，向特异性抗体包被酶标板中每孔加血清标本100μL，37℃孵育2h，双蒸水洗涤5min×3次，加显色剂显色2min，双蒸水洗涤5min×3次，洗板机拍干，用酶标仪（Bio-Rad 550型，美国）在450nm测定每孔的吸光度值，根据样品的吸光度值在制备标准曲线坐标上找出对应的bFGF和TGFβ1浓度（ng/L）。
1.5 统计学处理
应用SPSS11.0统计软件处理，计量资料以（）表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大体解剖观察
对照组大鼠骨皮质完整（图1A），模型组大鼠骨折线清晰（图1F），骨折7d（图1B）骨折断端被纤维性肉芽组织包围（针扎易透），至14d（图1C）纤维性骨痂形成、变硬（针扎有阻力），至21d（图1D）纤维性骨痂和软骨骨痂增多、中心硬度增大（针扎阻力增大），至28d（图1E）纤维性骨痂逐渐被软骨和骨性骨痂代替，硬度增大（针扎不透）。治疗组大鼠术后7～21d（图1G、H、I）骨痂结构与模型组相应时间点比较无明显差异，但至28d治疗组（图1J）骨痂硬度较模型组（图1E）明显增大（针扎不进）。 2.2 组织病理观察
对照组大鼠骨质结构正常（图2A），模型组大鼠在骨折当天骨折端断为血肿组织所填充（图2F），在骨折后7d（图2B）成纤维细胞自骨膜下增生长入骨折间隙，形成肉芽组织，夹杂少量成骨细胞，并有大量局部炎性细胞浸润，治疗组与模型组比较未见明显差异；至骨折14d（图2C）骨折端纤维性组
织、成骨细胞增多，形成大量纤维性骨痂及少量软骨骨痂，治疗组与模型组无明显差异；至骨折21d（图2D）破骨细胞、成骨细胞活跃，可见骨重塑腔隙、散在骨小梁形成，至28d（图2E）骨小梁清晰可见，排列规则，可见骨皮质及骨髓腔。治疗组骨架结构在7～21d（图2G、H、I）与模型组相应时间比较无显著性差异，但至28天治疗组骨细胞排列相对整齐清晰（图2J），显著优于骨折组（图2E）。
2.3 酶联免疫吸附检测
2.3.1 血清bFGF水平 在骨折后7、14、21、28d，对照组大鼠血清BMP7水平均未见显著性变化（t=0.36～1.47，P>0.05）。模型组大鼠血清bFGF水平，在骨折后7、14、21d也未见显著性变化（t=0.19～1.04，P>0.05），但均显著高于对照组（t=11.37～13.21，P<0.05），在骨折后28d显著下降（t=14.68，P<0.05）。治疗组大鼠血清bFGF水平在骨折后7、14和21d均无明显差异（t=0.38～1.60，P>0.05），骨折后28d显著下降（t=5.78，P<0.05）。但治疗组骨折后28d显著高于对照组及模型组（t=10.34～11.42，P<0.05）。见表1。
2.3.2 血清TGF-β1水平 对照组大鼠骨折后7、14、21、28d血清TGFβ1水平均未见显著性变化（t=0.09～0.84，P>0.05）。模型组大鼠血清TGFβ1水平在骨折后7、14、21d也未见显著性变化（t=0.29～0.38，P>0.05），但均显著高于对照组（t=9.02～9.93，P<0.05），在骨折后28d显著下降（t=7.54，P<0.05）。治疗组大鼠血清TGFβ1水平在骨折后7、14、21d均无明显差异（t=0.45～0.93，P>0.05），骨折后28d显著下降（t=5.78，P<0.05）。治疗组骨折后28d显著高于对照组及模型组（t=6.31～7.25，P<0.05）。见表2。
3 讨论
实验研究表明，bFGF通过调节成纤维细胞和成骨细胞的增殖、分化，并改变细胞产物的合成作用于成骨过程。bFGF不仅能促进骨细胞的生长，而且可以促进毛细血管的增生，改善局部血液供应，促进成骨细胞与支架材料的黏附[10]。Tatsuyama等[4]研究表明，在参与骨折修复过程中TGF-β1与bFGF有正协同作用，TGF-β1是bFGF的调控因子[11]。联合应用能协同刺激成骨细胞增殖，加速软骨内骨化的进程[12]。bFGF在骨折愈合各阶段有恒定的基因表达水平，一般是骨损伤初期表达强烈，达到高峰后逐渐减弱。Kawaguchi等[13]研究表明，内源性bFGF在骨折后1～3周内持续存在于骨折位点，王立平等[14]研究表明，从骨折后4d至3周内，bFGF表达强烈，随时间的推移逐渐减弱，bFGF早期表达能使骨端各种细胞分裂、增殖，使血肿机化形成肉芽组织，后期主要使间质细胞或成纤维细胞保持增殖活跃状态。
根据传统中医理论，骨折愈合过程可以分为早、中、后三期，根据辩证论者原则分别以活血化瘀、续筋接骨、滋补肝肾等方法促进骨折愈合。现代医学认为，骨折是骨的完整性和连续性中断，根据组织学和细胞学的变化，骨折愈合可分为三阶段（血肿机化、原始骨痂形成、骨痂改造塑型）[1]。国内学者应用中西医结合疗法治疗骨折取得了较好的临床疗效：黄佩军[6]应用壮筋续骨汤联合锁定加压钢板内固定治疗胫骨平台骨折有效率90%；对于肱骨骨折骨不连患者，现代医学单侧多功能外固定支架配合中药壮筋续骨汤内服，骨折愈合率高达97.4%[15]。在老年股骨粗隆间骨折的治疗中，梁士义等[16]采用动力髋螺钉固定配合壮筋续骨丹治疗，疗效满意。刘钟华等[17]应用现代药理学研究表明，丹参、川芎、红花等活血化瘀药在血肿机化期可以改善骨折断端局部血液循环，为骨痂的形成提供优越条件。周秋丽等[18]报道，在骨痂形成期续断、骨碎补参与骨折愈合过程，主要因其含有胶原、钙盐和微量元素，可促进蛋白合成代谢，有利于骨质修复。本次实验结果显示壮筋续骨汤在骨折后第1～3周内并没有提高大鼠血清中bFGF和TGFβ1水平，只是在21d后，能使骨生长因子继续保持较高水平，说明壮筋续骨汤并不能促进内源性骨生长因子分泌，在骨折愈合后期通过增强内源性因生物子活性、延长其半衰期、减缓其降解速度，维持血清bFGF和TGFβ1的水平，促进骨折愈合。
[参考文献]
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（收稿日期：2013-12-15）