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淡色库蚊尤其是雌蚊不但骚扰和叮刺人畜,而且能传播丝虫病和流行性乙型脑炎,对人类的健康危害很大。而通过选择性地抑制雌蚊的吸血或产卵,则有可能达到控制淡色库蚊繁殖和阻断相关疾病传播的目的。
本研究以淡色库蚊为研究对象,应用SSH技术建立了淡色库蚊性别差异表达cDNA文库,并在此基础上以半定量RT-PCR法对淡色库蚊雌蚊差异表达的基因进行了初步筛选,然后用RACE技术获取了一个雌蚊特异表达基因的全长序列,最后用RNA点杂交技术和Northern杂交技术对该基因进行了鉴定。
本实验在非专业实验室中对淡色库蚊进行了繁殖,并应用SSH技术,以淡色库蚊雌蚊成蚊的cDNA为Tester、雄蚊成蚊的cDNA为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以雄蚊成蚊的cDNA为Tester、雌蚊成蚊的cDNA为Driver,进行反向抑制性消减杂交。将正向SSH的第二轮抑制性PCR产物直接连接到pGEM-T easy载体中,转化到感受态细胞中培养,然后随机挑取100个经菌液PCR鉴定为阳性的单克隆进行测序,得到了98个EST序列。
根据98个EST序列中代表了单一DNA片段的64个EST序列,本实验设计了64对引物,以蚊虫的actin基因作为内参,分别以雌、雄蚊总RNA、mRNA或cDNA为模板.进行半定量RT-PCR。经过反复的检验,筛选出了淡色库蚊雌蚊特异表达的基因fs68。
为了进一步获得fs68基因的全长序列,本研究利用RACE技术,从淡色库蚊雌蚊mRNA中成功获得了fs68基因5和3端的序列信息。通过分析之后发现,fs68基因的序列长度为635 bp,开放阅读框为471 bp,编码156个氨基酸,分子量大约为17.57 kDa。将分析结果在美国生物信息中心网站进行在线BLAST分析发现,fs68基因序列的ORF序列与Culex pipiens quinquefasciatus的putative 15.8 kDa salivarypeptide mRNA存在着93%的相似性。这说明fs68基因可能代表一个唾液多肽,其具体的生物学功能尚需通过进一步的实验加以证明。<,2>~最后,本研究应用RNA点杂交和Northern杂交技术,对fs68基因的性别表达特异性及基因大小进行了进一步的研究。结果表明,fs68基因确实是淡色库蚊雌蚊特异表达的基因,其长度大约在1000 bases左右。
本研究应用SSH、半定量RT-PCR、RACE、RNA点杂交和Northern杂交、基因克隆等技术,对淡色库蚊雌蚊差异表达的基因进行了筛选和鉴定,为研制淡色库蚊性别控制疫苗或药物奠定了基础。