论文部分内容阅读
鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus, MHV)属于冠状病毒科冠状病毒属(Coronavirus),是一种单股正链RNA病毒,在实验动物中带毒小鼠存在非常广泛,在各实验室中均有发现。而其中不同类型、不同毒株病毒在不同年龄、品系和免疫状态的小鼠中均可发现,并且可引起肝炎、脑脊髓炎和肠炎等许多不同症状。在很多情况下,我们可以发现带毒小鼠呈隐性感染的占有很大比重,然而在鼠肝炎病毒与某些微生物发生混合感染时,或是在某些条件的刺激下我们会发现有疾病的爆发,鼠肝炎病毒是啮齿类实验动物感染的各种病毒中最难清除的病毒之一。感染鼠肝炎病毒的鼠群,其各种免疫应答参数会发生改变,对十实验结果产生各种影响,因此本实验开展了该病间接ELISA快速诊断方法的研究。本文首先根据GenBank中公布的MHV-A59N基因序列(AY700211),加入酶切位点与保护性碱基设计了一对特异性引物,然后通过RT-PCR扩增出N基因的主要抗原片段NS片段,将目的片段纯化后与pMD18-T载体连接得到重组质粒pMD18-T-N,双酶切胶回收目的基因片段克隆到原核表达载体pET-32a中,构建了重组质粒pET-32a-N,转化大肠菌Rossetta,用IPTG进行诱导表达获得融合蛋白,融合蛋白经纯化后,用SDS-PAGE对其进行验证,结果表明,原核表达的可融合性蛋白NP(S)分子量为43kDa,与预期计算的大小相符。用融合蛋白作为抗原制备多抗,Western blot和间接免疫荧光进行验证,表明该抗体特异性和敏感性很高。将纯化后的融合性原核表达蛋白NP(S)作为包被抗原,建立了检测鼠肝炎病毒血清的间接ELISA方法,进而对于间接ELISA的各种条件进行优化。结果表明,抗原的最佳包被浓度为300ng-mL-1,血清的最佳稀释度为1：200,最佳作用时间为120min,酶标抗体最佳稀释浓度为1：5000,最佳作用时问为60min,最佳封闭液为5%脱脂奶粉。经由敏感性试验、稳定性试验等试验方法进行检验,表明本研究建立的间接ELISA敏感性、重复性都非常好。应用此ELISA方法对从哈尔滨市收集的180份小鼠血清进行了检测,结果表明检测阳性率为7.22%。总之,该文为将来进一步深入研究MHV生物学特性及开发研制MHV血清抗体诊断试剂盒奠定了良好的基础。