【摘 要】
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氨是动物肠道中最主要的代谢毒性产物之一。它可以造成不同组织、器官和细胞的功能障碍,并引发相关疾病。而肠道是动物机体中最重要的器官之一,肠道结构的完整性与动物免疫、代谢、发育都有着密不可分的关系。不同内源或外源的刺激皆会造成肠道的损伤,引起相关的肠道疾病。因此,研究氨对肠上皮细胞结构和功能的影响,分析其可能产生影响的机制,对治疗氨过量而造成的肠道疾病具有重要意义。本研究以猪肠上皮细胞（IPEC-J2
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氨是动物肠道中最主要的代谢毒性产物之一。它可以造成不同组织、器官和细胞的功能障碍,并引发相关疾病。而肠道是动物机体中最重要的器官之一,肠道结构的完整性与动物免疫、代谢、发育都有着密不可分的关系。不同内源或外源的刺激皆会造成肠道的损伤,引起相关的肠道疾病。因此,研究氨对肠上皮细胞结构和功能的影响,分析其可能产生影响的机制,对治疗氨过量而造成的肠道疾病具有重要意义。本研究以猪肠上皮细胞（IPEC-J2）作为体外研究模型,研究氨、自由基代谢、肠上皮细胞凋亡和肠道屏障功能之间的关系,初步探讨氨对猪肠上皮细胞产生损伤的机制,为氨引起的猪肠道疾病的预防和治疗提供更多的参考。本研究主要研究结果如下:1.氨诱导猪肠上皮细胞（IPEC-J2）抗氧化能力的降低和凋亡本研究首选通过氨处理后细胞活力和形态的变化,确定氨浓度为40m M作为氨诱导细胞损伤的最适浓度。并进一步研究了氨处理对细胞抗氧化能力、通道蛋白、凋亡蛋白、炎症因子以及细胞屏障功能的影响。试验结果显示:（1）氨诱导的猪肠上皮细胞的ROS、MDA含量显著升高,SOD、GPx活力显著下降;线粒体膜电位显著降低,COX-2表达显著上调,细胞内游离钙离子(Ca2+)浓度显著增加,细胞凋亡率增加;（2）氨转运蛋白RHCG和水通道蛋白AQP-8的m RNA表达上调,氨进入到细胞内;凋亡相关分子Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax和p53的m RNA和蛋白表达水平均显著升高,抑凋亡分子Bcl-2的m RNA和蛋白表达水平均显著降低;（3）炎症因子IL-1β、IL-6和IL-8的m RNA显著升高;紧密连接分子Claudin-1和ZO-1的m RNA表达水平显著降低;同时,Claudin-1的蛋白表达水平显著降低。以上结果表明,氨进入细胞后,诱导了猪肠上皮细胞氧化应激,降低了细胞的抗氧化能力,导致线粒体膜电位下降,Ca2+浓度增加,同时激活了细胞线粒体途径和死亡受体途径两种凋亡方式,破坏了肠上皮细胞紧密连接结构的完整性,同时促进了细胞的炎症反应。2.抗氧化剂NAC缓解了氨诱导的猪肠上皮细胞（IPEC-J2）氧化损伤和凋亡为进一步探究氨诱导猪肠上皮细胞引起的氧化损伤和凋亡的机制,我们使用强效的抗氧化剂——NAC（N-乙酰半胱氨酸）处理细胞。NAC作为GSH的前体物质,可以强效清除ROS。本研究首先筛选出NAC的最佳处理浓度,利用该浓度和40m M的NH4Cl共处理细胞,检测细胞抗氧化能力、线粒体膜电位、凋亡相关因子、结构蛋白等变化情况。试验结果显示:（1）在氨刺激细胞后,添加NAC,细胞中的ROS和MDA含量降低,SOD、GPx活力升高,线粒体膜电位水平升高,COX-2表达显著下调,细胞内游离钙离子(Ca2+)浓度显著降低,细胞凋亡率下降;（2）凋亡相关分子Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、p53的m RNA和蛋白表达水平都显著降低,抑凋亡分子Bcl-2的m RNA和蛋白表达水平都显著升高;（3）紧密连接分子Claudin-1和ZO-1的m RNA表达水平显著增加;同时,Claudin-1的蛋白表达水平显著增加。以上结果表明,抗氧化剂NAC有助于清除细胞中的ROS,大大降低了氨对肠上皮细胞的损伤。综上所述,氨能够降低猪肠上皮细胞IPEC-J2活力,抑制细胞增殖,对细胞产生了严重的毒性作用。氨引起了ROS的过量产生,降低细胞的抗氧化能力,使得线粒体膜电位降低,细胞内游离的Ca2+浓度增加,造成Ca2+的蓄积及线粒体的损伤,并导致细胞凋亡,破坏了细胞间紧密连接完整性,造成肠上皮细胞的损伤。氨诱导猪肠上皮细胞凋亡可能是线粒体途径和死亡受体途径同时激活导致的结果。此外,抗氧化剂NAC可以通过清除细胞中的ROS,降低对猪肠上皮细胞的损伤。
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