【摘 要】
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随着动物医学的蓬勃发展,小动物临床上,肿瘤类疾病也逐渐成为危害犬猫等动物的主要疾病之一。其中,胰腺癌在犬中确诊后,其转移率几乎为100%,由于致死率高以及治疗难度大,胰腺癌严重危害动物的生命健康。本研究重点聚焦胰腺癌,希望为兽医临床以及大健康提出一种全新的思路。安罗替尼（AL3818）是一种新型多靶点酪氨酸激酶抑制剂,已被证实在多种肿瘤疾病中发挥良好效果,已被获批用于临床治疗非小细胞性肺癌（NSC
【基金项目】
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国家自然科学基金（NO.;31802255）； 中央高校基本科研业务费专项资金（No:2662017QD014）；
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随着动物医学的蓬勃发展,小动物临床上,肿瘤类疾病也逐渐成为危害犬猫等动物的主要疾病之一。其中,胰腺癌在犬中确诊后,其转移率几乎为100%,由于致死率高以及治疗难度大,胰腺癌严重危害动物的生命健康。本研究重点聚焦胰腺癌,希望为兽医临床以及大健康提出一种全新的思路。安罗替尼（AL3818）是一种新型多靶点酪氨酸激酶抑制剂,已被证实在多种肿瘤疾病中发挥良好效果,已被获批用于临床治疗非小细胞性肺癌（NSCLC）。由于安罗替尼本身具有成本低廉、安全性高效果好等特点,不仅为人类健康做出很大贡献,本研究更希望安罗替尼可以用在宠物临床上,为填补动物临床化疗药物缺失这一市场空白。本研究旨在探讨在胰腺癌（PC）细胞中,安罗替尼的抗肿瘤作用及其潜在的分子机制,为优化胰腺癌的治疗提出一种新的方案。为了研究安罗替尼的抗肿瘤效应和潜在机制,出于对动物福利和人文伦理的尊重,本研究使用了PANC-1、Bx PC-3和SW1990三种PC细胞系进行体外试验,使用五周龄的雌性BALB/C裸鼠进行体外药效验证试验。其主要结果如下:本研究使用CCK-8染色实验,平板克隆实验和Ed U检测法验证了安罗替尼对三种PC细胞的增殖抑制作用,细胞周期,细胞凋亡和活性氧（ROS）检测,以展示安罗替尼处理肿瘤细胞的表型。细胞生存率试验将细胞样本分为6组,分别为安罗替尼的浓度为0,2.5,5,10,20和40μM;体外试验均分为4组,根据药物浓度分为无药物组（0.1%DMSO）,低剂量组（5μM）,中剂量组（10μM）和高剂量组（20μM）,根据时间梯度分为对照组（0.1%DMSO）,低时长（12 h）,中等时长（24 h）和长时长组（48 h）。结果发现,安罗替尼对PC细胞系的IC50范围为3.762μM至18.31μM,使用安罗替尼治疗均可以使PC细胞的增殖受到不同程度的抑制（p＜0.05）,细胞分裂停滞在G2/M期（p＜0.05）,但12 h处理无明显变化,细胞凋亡也随着给药浓度的增加有显著差异（p＜0.01）。结果表明,安罗替尼抑制了PC细胞系的增殖,诱导G2/M期阻滞并触发细胞凋亡。利用转录组分析,将细胞样本分为2组,对照组与处理组,GO富集后发现细胞内部的ER应激途径蛋白有不同程度的改变。进一步验证ER应激通路以及ROS的上下游关系,本研究使用了salubrinal和NAC两种抑制剂分别抑制ER应激通路和ROS的产生。试验结果表明抑制ER应激可以缓解安罗替尼诱导的细胞凋亡（p＜0.05）,与此同时,抑制ROS的产生可以抑制ER应激途径中PERK/p-e IF2α/ATF通路蛋白以及细胞凋亡（p＜0.05）。说明了安罗替尼导致活性氧（ROS）的积累,而ROS的聚集通过上调PERK/p-e IF2α/ATF4通路激活内质网（ER）应激。最后,本研究发现抗氧化物质Nrf2的蛋白表达水平随着安罗替尼治疗的剂量增加而上调并首次提出将安罗替尼和Nrf2干扰同时用于治疗胰腺癌。体内外验证试验分为4组,空白组,无义序列对照组,单药治疗组和Nrf2敲低和药物联用组。试验结果表明,Nrf2基因敲低可增强安罗替尼的促凋亡作用（p＜0.05）,其潜在靶向通路可能也为PERK/p-e IF2α/ATF4通路。体内研究中,本研究使用小鼠成瘤实验和免疫组织化学法检测安罗替尼在体内的治疗效果。体内试验结果表明,抑制Nrf2基因增强了安罗替尼对PC细胞的抑制作用,延缓了肿瘤生长,证实了在动物内,药物联用可以更加有效的抑制肿瘤（p＜0.05）,发挥其肿瘤杀伤效应,为临床使用提供了理论依据。综上所述,安罗替尼通过ROS聚集激活细胞内ER应激通路蛋白PERK/pe IF2α/ATF,最终引起细胞凋亡。干扰Nrf2同时联用安罗替尼治疗可以更大程度的发挥安罗替尼产生ROS的潜能,增加安罗替尼的治疗效果。
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