【摘 要】
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猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）能够在猪的三叉神经节建立终生潜伏与再激活,引发猪的伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,给养猪业带来严重的经济损失。2011年以来,中国猪场相继爆发伪狂犬病,被证明为新变异毒株。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lnc RNA）是最普遍且功能最多样化的一类没有编码蛋白能力的RNA,长度超过200 nt。Lnc
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猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）能够在猪的三叉神经节建立终生潜伏与再激活,引发猪的伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,给养猪业带来严重的经济损失。2011年以来,中国猪场相继爆发伪狂犬病,被证明为新变异毒株。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lnc RNA）是最普遍且功能最多样化的一类没有编码蛋白能力的RNA,长度超过200 nt。Lnc RNA可促进多种生物学功能,包括细胞结构完整性、细胞周期、重编程和凋亡。病毒已经进化出各种策略来逃避宿主的抵御,长链非编码RNA被证明在其中发挥重要的作用。LEULR是位于PRV基因组3-254 bp的长链非编码RNA,为研究LEULR在PRV生命周期中所发挥的功能,本课题的研究内容如下:1.LEULR在不同毒株间的同源性分析为了了解LEULR在不同毒株之间的变异情况,选取国内外PRV经典毒株以及变异毒株,对LEULR序列进行同源性分析以及进化树分析,发现LEULR在不同毒株间的保守度高。2.LEULR在PK-15细胞上的转录时序为了进一步研究LEULR的表达情况,PRV Ea株感染PK-15细胞,分别于不同时间点检测LEULR的表达量。结果发现LEULR在PRV感染后开始少量表达,感染后9 h大量表达,感染后24 h表达丰度达到最高,之后开始逐渐下降。3.构建LEULR缺失株以及回复突变株为了研究LEULR的功能,利用细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）平台以及同源重组的方法构建LEULR缺失株rPRVΔLEULR以及回复突变株rPRVΔLEULR R,提取重组病毒的基因组并测序,证明成功在PRV基因组上缺失LEULR序列以及回复LEULR序列。4.LEULR对PRV复制的影响将WT PRV Ea、rPRVΔLEULR、rPRVΔLEULR R以5 MOI感染PK15细胞,检测病毒的一步法增殖曲线;将WT PRV Ea、rPRVΔLEULR、rPRVΔLEULR R以0.01 MOI感染PK-15细胞,检测病毒的多步法增殖曲线;检测WT PRV Ea、rPRVΔLEULR、rPRVΔLEULR R的空斑大小。结果发现LEULR对于PRV的一步法增殖曲线、多步法增殖曲线以及空斑大小均没有影响。证明LEULR对于PRV的复制是非必需的。5.LEULR对PRV毒力的影响将WT PRV Ea、rPRVΔLEULR、rPRVΔLEULR R、PK15细胞裂解液（对照）以10~4 PFU/只注射BLAB/c小鼠,每天观察小鼠的症状以及死亡情况。结果发现LEULR不影响PRV对小鼠造成的神经症状以及致死率。6.猪的PRV潜伏以及再激活模型三叉神经节中LEULR的表达取Mock、PRV潜伏、PRV再激活的猪三叉神经节样品,提取总RNA,RT-q PCR检测是否有LEULR的表达。结果发现LEULR在PRV潜伏的三叉神经节中有表达,在再激活样品中没有表达,提示LEULR可能参与PRV的潜伏过程。总之,本课题研究发现LEULR在不同毒株间保守度高,表达丰度在PRV感染PK-15细胞后24 h达到最高。本课题成功构建LEULR缺失株以及回复突变株,发现LEULR不影响PRV的复制以及毒力。但是PRV潜伏的猪三叉神经节样品中检测到LEULR的表达,提示LEULR可能参与PRV的潜伏过程。
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