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乳腺癌是女性最常见的癌症,是全球女性死亡的主要原因之一。
乳腺癌治疗效果差往往与大多数患者出现肿瘤局部或远处转移相关。因此,找到有效且特异性强的生物标记物预测乳腺癌增殖和侵袭转移和开发新治疗方案是必要的。
自主增殖是恶性肿瘤的一个重要标志,肿瘤增殖活性增强,是肿瘤细胞发生侵袭转移前提和基础。上皮-间质化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)使肿瘤细胞形态改变,粘附性下降,上皮细胞丧失上皮细胞特征,获得间质化表型,对肿瘤侵袭转移发挥了关键性作用。
TGM2(基因:TGM2;蛋白质:TG2)是一种多功能基因,编码产生一个与应激反应相关,结构复杂,多功能的蛋白质称为组织型转谷氨酰胺酶(TG2或tTG)。TG2在调节参与肿瘤细胞生存、增生、血管生成、侵袭和转移等相关蛋白质功能方面发挥重要作用。在裸鼠胰腺癌细胞移植瘤中沉默的TGM2表达,会显著抑制裸鼠胰腺癌细增殖和移植瘤的生长。TG2促使卵巢癌细胞上皮间质转化,提高了癌细胞侵袭转移能力。现我们研究TG2对乳腺癌细胞增殖和侵袭转移影响。
第一部分 TGM2慢病毒干扰载体构建与鉴定
目的：构建人TGM2基因RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,并评价其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的干扰效果。
方法：通过DNA重组方法构建GV115(hU6-MCS-CMV-EGFP)-TGM2表达载体。双链寡核苷酸(ds01igo)随后经DNA测序分析证实。将质粒GV115-TGM2、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293 T细胞,包装产生慢病毒。转染293 T细胞后,鉴定EGFP表达,计算出慢病毒的功能滴度。Real-Time PCR检测在MDA-MB-231细胞中TGM2-RNAi-LV的沉默效果。
结果：构建TGM2-RNAi-LV表达载体,共转染后293 T细胞包装产生病毒。感染TGM2-RNAi-LV后,TGM2mRNA在MDA-MB-231细胞中表达明显下调。
结论：成功构建出针对人TGM2基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,体外感染乳腺癌细胞MDA-MB-231后可有效抑制TGM2基因表达。为研究TGM2基因对乳腺癌细胞增殖、侵袭转移作用提供了一个研究工具。
第二部分 体外沉默TGM2抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭转移作用
目的：明确TG2对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭转移的影响。
方法：MTT法和集落形成试验检测细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。使用划痕实验研究TG2对其体外迁移运动能力的影响;应用transwell侵袭实验研究TG2对人乳腺癌MDA-MB-231细胞体外侵袭运动能力的影响。Western Blot检测 TG2、p-AKT、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin、Snail和cyclin D1表达水平。
结果：体外实验表明,与对照组相比RNAi组细胞周期阻滞于G0/G1期,S期的比例明显降低;体外迁移运动和侵袭能力明显下降。下调TG2表达诱导MDA-MB-231细胞由间质样细胞形态向上皮样细胞形态转变。Western Blot检测RNAi组TG2,p-AKT, Bcl-2,cyclinD1,间质性Vimentin和Snail蛋白的表达下降;上皮性标志物E-cadherin表达上调。
结论：干扰TGM2表达可能诱导MDA-MB-231细胞凋亡和抑制MDA-MB-231细胞生长、增殖,迁移侵袭能力。
第三部分 沉默TGM2基因对乳腺癌裸鼠移植瘤抑制作用
目的：观察沉默TGM2表达对乳腺癌裸鼠移植瘤生长增殖和侵袭转移抑制作用。
方法：建立裸鼠原位移植瘤模型,用游标卡尺测量肿瘤最长径和最短径,观察肿瘤体积变化。根据公式计算体积:Volume(mm3)=L×W2/2（L最长径,W为最短径）。裸鼠六周后处死,收集肿瘤。肿瘤抑制率是根据公式计算[1-(R/N)]×100（R和N代表RNAi和NC组终体积）。免疫组织化学检测移植瘤中TG2、Ki67、MMP-9和MVD(CD34)表达水平。
结果：在裸鼠移植瘤实验中发现,TG2低表达组裸鼠乳垫下移植瘤生长较对照组明显缓慢,肿瘤的终体积抑制率约36.9％。通过免疫组检测,TG2低表达组Ki-67、MMP-9和MVD(CD34)表达水平下降。
结论：沉默TGM2抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长、增殖,降低Ki-67、MMP-9和MVD(CD34)表达,提示TG2可能在体内促进乳腺癌细胞增殖和侵袭转移作用。
第四部分 人乳腺癌组织中TG2表达及其与临床病理特征的关系
目的：阐明人乳腺癌组织中TG2的表达及其与临床病理特征的关系。
方法：行免疫组化检测乳腺癌组织TG2,Ki67和MMP-9的表达水平,在可评估107例乳腺癌患者标本中,分析其表达水平与临床病理特征关系。我们在微阵列数据集搜索在乳腺癌TGM2差异表达基因。在GSE8977芯片中TGM2cRNA经0NCOMINE数据库分析差异表达。
结果：乳腺癌组织（可评估107例乳腺癌患者）中TG2阳性表达率高于癌旁组织。生物信息学分析显示,TGM2cRNA在乳腺癌中呈高表达（p＜0.001）。TG2蛋白表达与肿瘤大小（x2=4.82,P=0.028）、淋巴结转移(x2=12.38,P＜0.001)、TNM分期（x2=11.259,P=0.001）具有显著的相关性。TG2的表达水平与不同年龄、组织学分级、停经与否无统计学差异。Spearman相关分析显示,TG2蛋白表达水平与Ki-67(r=0.34,p＜0.001)和MMP-9(r=0.36,p＜0.001)表达水平呈正相关。
结论：TG2可能对乳腺癌增生和侵袭迁移转移作用密切相关,可作为在乳腺癌患者临床诊断和预后一种新型生物标志物。
乳腺癌治疗效果差往往与大多数患者出现肿瘤局部或远处转移相关。因此,找到有效且特异性强的生物标记物预测乳腺癌增殖和侵袭转移和开发新治疗方案是必要的。
自主增殖是恶性肿瘤的一个重要标志,肿瘤增殖活性增强,是肿瘤细胞发生侵袭转移前提和基础。上皮-间质化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)使肿瘤细胞形态改变,粘附性下降,上皮细胞丧失上皮细胞特征,获得间质化表型,对肿瘤侵袭转移发挥了关键性作用。
TGM2(基因:TGM2;蛋白质:TG2)是一种多功能基因,编码产生一个与应激反应相关,结构复杂,多功能的蛋白质称为组织型转谷氨酰胺酶(TG2或tTG)。TG2在调节参与肿瘤细胞生存、增生、血管生成、侵袭和转移等相关蛋白质功能方面发挥重要作用。在裸鼠胰腺癌细胞移植瘤中沉默的TGM2表达,会显著抑制裸鼠胰腺癌细增殖和移植瘤的生长。TG2促使卵巢癌细胞上皮间质转化,提高了癌细胞侵袭转移能力。现我们研究TG2对乳腺癌细胞增殖和侵袭转移影响。
第一部分 TGM2慢病毒干扰载体构建与鉴定
目的：构建人TGM2基因RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,并评价其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的干扰效果。
方法：通过DNA重组方法构建GV115(hU6-MCS-CMV-EGFP)-TGM2表达载体。双链寡核苷酸(ds01igo)随后经DNA测序分析证实。将质粒GV115-TGM2、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293 T细胞,包装产生慢病毒。转染293 T细胞后,鉴定EGFP表达,计算出慢病毒的功能滴度。Real-Time PCR检测在MDA-MB-231细胞中TGM2-RNAi-LV的沉默效果。
结果：构建TGM2-RNAi-LV表达载体,共转染后293 T细胞包装产生病毒。感染TGM2-RNAi-LV后,TGM2mRNA在MDA-MB-231细胞中表达明显下调。
结论：成功构建出针对人TGM2基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,体外感染乳腺癌细胞MDA-MB-231后可有效抑制TGM2基因表达。为研究TGM2基因对乳腺癌细胞增殖、侵袭转移作用提供了一个研究工具。
第二部分 体外沉默TGM2抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭转移作用
目的：明确TG2对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭转移的影响。
方法：MTT法和集落形成试验检测细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。使用划痕实验研究TG2对其体外迁移运动能力的影响;应用transwell侵袭实验研究TG2对人乳腺癌MDA-MB-231细胞体外侵袭运动能力的影响。Western Blot检测 TG2、p-AKT、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin、Snail和cyclin D1表达水平。
结果：体外实验表明,与对照组相比RNAi组细胞周期阻滞于G0/G1期,S期的比例明显降低;体外迁移运动和侵袭能力明显下降。下调TG2表达诱导MDA-MB-231细胞由间质样细胞形态向上皮样细胞形态转变。Western Blot检测RNAi组TG2,p-AKT, Bcl-2,cyclinD1,间质性Vimentin和Snail蛋白的表达下降;上皮性标志物E-cadherin表达上调。
结论：干扰TGM2表达可能诱导MDA-MB-231细胞凋亡和抑制MDA-MB-231细胞生长、增殖,迁移侵袭能力。
第三部分 沉默TGM2基因对乳腺癌裸鼠移植瘤抑制作用
目的：观察沉默TGM2表达对乳腺癌裸鼠移植瘤生长增殖和侵袭转移抑制作用。
方法：建立裸鼠原位移植瘤模型,用游标卡尺测量肿瘤最长径和最短径,观察肿瘤体积变化。根据公式计算体积:Volume(mm3)=L×W2/2（L最长径,W为最短径）。裸鼠六周后处死,收集肿瘤。肿瘤抑制率是根据公式计算[1-(R/N)]×100（R和N代表RNAi和NC组终体积）。免疫组织化学检测移植瘤中TG2、Ki67、MMP-9和MVD(CD34)表达水平。
结果：在裸鼠移植瘤实验中发现,TG2低表达组裸鼠乳垫下移植瘤生长较对照组明显缓慢,肿瘤的终体积抑制率约36.9％。通过免疫组检测,TG2低表达组Ki-67、MMP-9和MVD(CD34)表达水平下降。
结论：沉默TGM2抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长、增殖,降低Ki-67、MMP-9和MVD(CD34)表达,提示TG2可能在体内促进乳腺癌细胞增殖和侵袭转移作用。
第四部分 人乳腺癌组织中TG2表达及其与临床病理特征的关系
目的：阐明人乳腺癌组织中TG2的表达及其与临床病理特征的关系。
方法：行免疫组化检测乳腺癌组织TG2,Ki67和MMP-9的表达水平,在可评估107例乳腺癌患者标本中,分析其表达水平与临床病理特征关系。我们在微阵列数据集搜索在乳腺癌TGM2差异表达基因。在GSE8977芯片中TGM2cRNA经0NCOMINE数据库分析差异表达。
结果：乳腺癌组织（可评估107例乳腺癌患者）中TG2阳性表达率高于癌旁组织。生物信息学分析显示,TGM2cRNA在乳腺癌中呈高表达（p＜0.001）。TG2蛋白表达与肿瘤大小（x2=4.82,P=0.028）、淋巴结转移(x2=12.38,P＜0.001)、TNM分期（x2=11.259,P=0.001）具有显著的相关性。TG2的表达水平与不同年龄、组织学分级、停经与否无统计学差异。Spearman相关分析显示,TG2蛋白表达水平与Ki-67(r=0.34,p＜0.001)和MMP-9(r=0.36,p＜0.001)表达水平呈正相关。
结论：TG2可能对乳腺癌增生和侵袭迁移转移作用密切相关,可作为在乳腺癌患者临床诊断和预后一种新型生物标志物。