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miR-302家族是胚胎干细胞(ESC)特异性的miRNA家族。研究发现miR-302s作为增强子可以提高体细胞重编程(SCR)效率，其单独使用可以获得人和小鼠诱导多能干细胞(iPSC)。目前对大家畜miR-302家族的序列和功能研究报道较少，仅有miR-302s促进SCR的研究。为了探讨miR-302家族在大家畜SCR过程中的功能及作用机制，本研究克隆了水牛miR-302s序列，并构建真核表达载体，将其应用于重编程巴马猪成纤维细胞(PFF)为诱导多能干细胞，重点探讨了四转录因子(OSKM)与miR-302s两种方法诱导PFF为多能干细胞进程中的细胞转变过程及相关基因表达的差异。研究结果如下：
1.水牛miR-302s真核表达载体的构建
克隆并构建了水牛miR-302s的慢病毒表达载体(bbu-miR-302s)，并进行生物信息学分析。测序结果显示，扩增获得的是水牛miR-302家族序列，其位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区域。miR-302家族成员之间以及miR-302家族在不同物种间均高度保守。预测水牛miR-302s主要靶基因共有255个，这些靶基因主要集中在33个通路中，其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导以及调控干细胞信号通路最为显著。bbu-miR-302s慢病毒颗粒可以感染人、水牛和猪三个物种的体细胞。
2.miR-302s重编程巴马猪成纤维细胞为诱导多能干细胞的研究
采用bbu-miR-302s病毒感染方法对巴马香猪成纤维细胞进行重编程，结果显示，miR-302s可以诱导其重编程为猪诱导多能干细胞(miR-302-piPSC)。获得的miR-302-piPSC具有碱性磷酸酶活性，RT-PCR结果显示miR-302-piPSC表达猪内源性的OCT4和SOX2基因。免疫组化结果表明，miR-302-piPSC表达多能性标记物OCT4、SOX2、FGF5、STAT3。体外分化实验结果显示，miR-302-piPSC体外可形成拟胚体(EB)，且可以检测到三胚层标记基因的表达。与OSKM介导的重编程相比，miR-302s介导的重编程效率低，周期长，且miR-302-piPSC内没有检测到SSEA1、SSEA4、Tra-1-60与Tra-1-81等干细胞标记物，无内源基因NANOG的表达。
3.miR-302s诱导巴马猪成纤维细胞重编程过程中间充质-上皮转化的研究
在miR-302s介导的SCR过程中发现细胞发生上皮样形态学改变，为了探索miR-302s重编程过程中是否发生了间充质-上皮的转化(MET)，对miR-302s病毒感染后的PFF进行了粘附能力检测、鬼笔环肽(Phalloidin)染色以及上皮细胞和间充质细胞分子标志基因的检测。粘附能力检测结果显示，与对照组相比，miR-302s组细胞显示出更为显著的贴附能力(P＜0.01)。qRT-PCR结果显示，miR-302s感染后5天，上皮细胞标志基因包括细胞粘附蛋白(E-钙粘蛋白和Bves)、紧密连接蛋白Occludin、细胞角蛋白(Krt18)表达显著上升(P＜0.05)；间充质细胞标记基因包括波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白1(FN1)、蛋白质胶原蛋白家族Col1a1和基质金属蛋白酶家族(MMP14)的表达显著下调(P＜0.05)。鬼笔环肽染色结果显示，与对照组相比，miR-302s破坏了细胞的肌动蛋白应力纤维。以上结果表明，miR-302s介导的猪成纤维细胞重编程过程中发生了MET。定量PCR结果还发现，随着诱导时间的增长，间充质细胞相关基因(Coll1a1、Vimentin、FN1、Snail、MMP14)呈先升后降趋势。上皮细胞相关基因(E-cadherin、Bves、Krt18、Occludin)呈先降后升趋势。说明miR-302s诱导过程中，体细胞先经过EMT，再经过MET，然后到达多能状态。而OSKM介导的重编程过程中，体细胞是直接经过MET到达多能状态。
4.miR-302s与OSKM诱导巴马猪成纤维细胞重编程过程中的相关基因差异表达分析
为了探讨miR-302s与OSKM在巴马猪体细胞重编程过程中的作用机制，采用RNA-seq方法分析筛选差异表达基因(DEGs)。RNA-seq结果显示，与对照组相比，OSKM组有DEGs8887个，miR-302s组有DEGs4618个，两者共同的DEGs有3954个，占PFF VSOSKM组DEGs的44.5%，占PFF VS miR-302组DEGs的85.6%。KEGG分析发现，miR-302s特异表达的DEGs主要富集在β-丙氨酸代谢、组氨酸代谢、PI3K-Akt信号通路、细胞外基质(ECM)-受体相互作用以及糖酵解信号通路等。OSKM特异表达的DEGs主要富集到氧化磷酸化信号通路、粘附力信号通路、Wnt信号通路等。
利用I-Sanger云平台的基因检索功能，对重编程过程中重要的目标基因进行查询并绘制其表达量的趋势图。与对照组相比，miR-302s组上皮细胞的标记基因闭合蛋白(Occludin)、细胞角蛋白(Krt18，Krt8)表达均上调，间充质细胞标记基因Col1a1、MMP12、Snail1的表达下调，Vimentin、MMP14、FN1表达上调，进一步说明miR-302s重编程过程中可能存在EMT。表观遗传学相关基因DNA甲基化酶以及甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)和组蛋白去乙酰化酶的表达水平均下调，表明miR-302s可以通过调控表观遗传修饰影响SCR。
以上结果表明，单独应用miR-302家族可以将猪体细胞重编程为诱导多能干细胞。miR-302s重编程过程中，体细胞需先经历EMT后再经过MET过程形成piPSC。miR-302s可能是通过作用于EMT-MET、调控表观遗传修饰、糖酵解以及PI3K信号通路来促进重编程的。
1.水牛miR-302s真核表达载体的构建
克隆并构建了水牛miR-302s的慢病毒表达载体(bbu-miR-302s)，并进行生物信息学分析。测序结果显示，扩增获得的是水牛miR-302家族序列，其位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区域。miR-302家族成员之间以及miR-302家族在不同物种间均高度保守。预测水牛miR-302s主要靶基因共有255个，这些靶基因主要集中在33个通路中，其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导以及调控干细胞信号通路最为显著。bbu-miR-302s慢病毒颗粒可以感染人、水牛和猪三个物种的体细胞。
2.miR-302s重编程巴马猪成纤维细胞为诱导多能干细胞的研究
采用bbu-miR-302s病毒感染方法对巴马香猪成纤维细胞进行重编程，结果显示，miR-302s可以诱导其重编程为猪诱导多能干细胞(miR-302-piPSC)。获得的miR-302-piPSC具有碱性磷酸酶活性，RT-PCR结果显示miR-302-piPSC表达猪内源性的OCT4和SOX2基因。免疫组化结果表明，miR-302-piPSC表达多能性标记物OCT4、SOX2、FGF5、STAT3。体外分化实验结果显示，miR-302-piPSC体外可形成拟胚体(EB)，且可以检测到三胚层标记基因的表达。与OSKM介导的重编程相比，miR-302s介导的重编程效率低，周期长，且miR-302-piPSC内没有检测到SSEA1、SSEA4、Tra-1-60与Tra-1-81等干细胞标记物，无内源基因NANOG的表达。
3.miR-302s诱导巴马猪成纤维细胞重编程过程中间充质-上皮转化的研究
在miR-302s介导的SCR过程中发现细胞发生上皮样形态学改变，为了探索miR-302s重编程过程中是否发生了间充质-上皮的转化(MET)，对miR-302s病毒感染后的PFF进行了粘附能力检测、鬼笔环肽(Phalloidin)染色以及上皮细胞和间充质细胞分子标志基因的检测。粘附能力检测结果显示，与对照组相比，miR-302s组细胞显示出更为显著的贴附能力(P＜0.01)。qRT-PCR结果显示，miR-302s感染后5天，上皮细胞标志基因包括细胞粘附蛋白(E-钙粘蛋白和Bves)、紧密连接蛋白Occludin、细胞角蛋白(Krt18)表达显著上升(P＜0.05)；间充质细胞标记基因包括波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白1(FN1)、蛋白质胶原蛋白家族Col1a1和基质金属蛋白酶家族(MMP14)的表达显著下调(P＜0.05)。鬼笔环肽染色结果显示，与对照组相比，miR-302s破坏了细胞的肌动蛋白应力纤维。以上结果表明，miR-302s介导的猪成纤维细胞重编程过程中发生了MET。定量PCR结果还发现，随着诱导时间的增长，间充质细胞相关基因(Coll1a1、Vimentin、FN1、Snail、MMP14)呈先升后降趋势。上皮细胞相关基因(E-cadherin、Bves、Krt18、Occludin)呈先降后升趋势。说明miR-302s诱导过程中，体细胞先经过EMT，再经过MET，然后到达多能状态。而OSKM介导的重编程过程中，体细胞是直接经过MET到达多能状态。
4.miR-302s与OSKM诱导巴马猪成纤维细胞重编程过程中的相关基因差异表达分析
为了探讨miR-302s与OSKM在巴马猪体细胞重编程过程中的作用机制，采用RNA-seq方法分析筛选差异表达基因(DEGs)。RNA-seq结果显示，与对照组相比，OSKM组有DEGs8887个，miR-302s组有DEGs4618个，两者共同的DEGs有3954个，占PFF VSOSKM组DEGs的44.5%，占PFF VS miR-302组DEGs的85.6%。KEGG分析发现，miR-302s特异表达的DEGs主要富集在β-丙氨酸代谢、组氨酸代谢、PI3K-Akt信号通路、细胞外基质(ECM)-受体相互作用以及糖酵解信号通路等。OSKM特异表达的DEGs主要富集到氧化磷酸化信号通路、粘附力信号通路、Wnt信号通路等。
利用I-Sanger云平台的基因检索功能，对重编程过程中重要的目标基因进行查询并绘制其表达量的趋势图。与对照组相比，miR-302s组上皮细胞的标记基因闭合蛋白(Occludin)、细胞角蛋白(Krt18，Krt8)表达均上调，间充质细胞标记基因Col1a1、MMP12、Snail1的表达下调，Vimentin、MMP14、FN1表达上调，进一步说明miR-302s重编程过程中可能存在EMT。表观遗传学相关基因DNA甲基化酶以及甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)和组蛋白去乙酰化酶的表达水平均下调，表明miR-302s可以通过调控表观遗传修饰影响SCR。
以上结果表明，单独应用miR-302家族可以将猪体细胞重编程为诱导多能干细胞。miR-302s重编程过程中，体细胞需先经历EMT后再经过MET过程形成piPSC。miR-302s可能是通过作用于EMT-MET、调控表观遗传修饰、糖酵解以及PI3K信号通路来促进重编程的。