论文部分内容阅读
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是一种能够引起结核病(tuberculosis ,TB)的典型胞内寄生菌，主要寄生于巨噬细胞内。巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞之一，在免疫防御和炎症反应中起核心作用。结核杆菌RD-1区(Region of difference，1)基因所编码的蛋白是结核分支杆菌的主要毒力因子之一，在结核分枝杆菌侵染机体的过程中发挥巨大的作用。据调查，Mtb感染细胞后可引起包括凋亡，坏死，焦亡，和自噬在内的多种死亡方式。而随着结核分枝杆菌耐药性的发展，宿主细胞和分枝杆菌蛋白之间的相互作用对研究结核病的发病机制显得尤为重要。本研究以结核分枝杆菌RD-1区基因为主要对象，构建RD-1区基因pEGFP-C1重组真核表达载体，并利用脂质体法分别转染RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞，观察不同重组表达载体的转染效率。然后利用流式细胞术检测各组巨噬细胞的凋亡率和细胞周期；Realtime-PCR法检测各组细胞坏死相关基因和焦亡相关基因的表达水平；Western-Blot法检测结核杆菌Rv3875蛋白表达水平及引起的细胞焦亡相关因子变化情况。本研究中得到的结果如下：
1.成功构建了pEGFP-C1-Rv3871、pEGFP-C1-Rv3872、pEGFP-C1-Rv3873、pEGFP-C1-Rv3874、pEGFP-C1-Rv3875、pEGFP-C1-Rv3876、pEGFP-C1-Rv3877、pEGFP-C1-Rv3878共8个结核分枝杆菌RD-1区基因重组真核表达载体。
2.通过荧光显微镜观察RD-1区基因重组真核表达载体均能成功转染RAW264.7细胞且有绿色荧光。
3.利用流式细胞术分析发现结核分枝杆菌蛋白Rv3871、Rv3875、Rv3876能够诱导凋亡。
4.Realtime-PCR对巨噬细胞内坏死/焦亡细胞因子检测表明，Rv3877能够诱导MLKL、RIP1、RIP3等坏死相关因子表达量上调。Rv3875能够诱导GSDMD、caspase-1、IL-18、IL-1β等焦亡相关因子表达量上调。
这些结果表明，RD-1区蛋白能够激活巨噬细胞的不同死亡方式。这一结果对于探究RD-1区蛋白作用机理提供理论参考，并为新型疫苗的研制奠定基础。
1.成功构建了pEGFP-C1-Rv3871、pEGFP-C1-Rv3872、pEGFP-C1-Rv3873、pEGFP-C1-Rv3874、pEGFP-C1-Rv3875、pEGFP-C1-Rv3876、pEGFP-C1-Rv3877、pEGFP-C1-Rv3878共8个结核分枝杆菌RD-1区基因重组真核表达载体。
2.通过荧光显微镜观察RD-1区基因重组真核表达载体均能成功转染RAW264.7细胞且有绿色荧光。
3.利用流式细胞术分析发现结核分枝杆菌蛋白Rv3871、Rv3875、Rv3876能够诱导凋亡。
4.Realtime-PCR对巨噬细胞内坏死/焦亡细胞因子检测表明，Rv3877能够诱导MLKL、RIP1、RIP3等坏死相关因子表达量上调。Rv3875能够诱导GSDMD、caspase-1、IL-18、IL-1β等焦亡相关因子表达量上调。
这些结果表明，RD-1区蛋白能够激活巨噬细胞的不同死亡方式。这一结果对于探究RD-1区蛋白作用机理提供理论参考，并为新型疫苗的研制奠定基础。