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树舌(Ganoderma applanatum)是一种常见的食药用真菌，具有抗肿瘤、抗氧化、参加机体免疫调节等生物活性。多糖是树舌中最重要的活性物质之一。树舌多糖(Ganoderma applanatum polysaccharide，GAP)的抗肿瘤活性已有相关的研究和报道，本实验室前期关于纯化所得树舌均一多糖活化线粒体途径进而诱导细胞凋亡已有相关研究，为了进一步探讨树舌多糖的抗肿瘤机制，本研究主要从自噬方面入手，以期阐明树舌多糖通过自噬途径的抗肿瘤机制及抗肿瘤过程中信号转导途径。
研究方法：使用化学试剂法检测GAP中化学组成成分，高效液相法检测GAP的分子量与单糖组成，使用红外光谱分析GAP组成基团。使用MTT法检测GAP对MCF-7细胞增殖抑制的影响，结晶紫染色观察细胞形态，Hoechst33258实验观察细胞核变化，细胞划痕实验观察细胞侵袭能力。MDC染色检测细胞自噬小泡，免疫荧光检测自噬标志荧光蛋白LC3表达，荧光定量PCR检测自噬相关因子LC3、Beclin-1和mTORmRNA表达水平，AnnexinV-FITC/PI双染检测GAP对MCF-7细胞凋亡的影响。Westernblot法检测自噬和凋亡相关蛋白β-Actin、LC3、Beclin-1、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK表达水平。
实验结果如下：
1.实验所需树舌多糖GAP包含三种不同分子量的多糖，其分子量分别为6.36×105Da、4.25×105Da和2.53×105Da；GAP由鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成，其比例为1∶22∶16.1∶3.2；红外光谱分析显示，GAP含有β-呋喃糖等结构。
2.MTT结果表明GAP能够以剂量和时间依赖性方式抑制MCF-7细胞的增殖，且对人正常乳腺上皮细胞MCF-10A毒性较小。使用结晶紫染色法观察细胞形态、细胞划痕法观察细胞迁移率、Hoechst33258染色法观察细胞核变化，一系列形态学研究结果表明：GAP能够诱导MCF-7细胞形态变化、细胞边缘发生羽化、细胞迁移能力下降、染色质发生固缩，同时能降低MCF-7细胞存活率。
3.MDC染色法检测自噬小泡，表明GAP可以诱导MCF-7细胞发生自噬，免疫荧光分析GAP可以诱导细胞发生自噬，并检测到LC3免疫荧光斑点，实时荧光定量PCR和Westernblot结果表明自噬相关标志物LC3-II、Beclin-1的基因和蛋白表达水平均上调；GAP中加入自噬晚期抑制剂CQ显著提高了LC3-II的蛋白表达水平。
4.流式细胞术分析表明GAP增加MCF-7细胞凋亡细胞比例,Westernblot法检测凋亡相关蛋白表达情况，结果表明，Bax/Bcl-2蛋白表达量上升，Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量均随GAP浓度的升高而提高，说明GAP可以诱导MCF-7细胞凋亡。
5.GAP能够激活MCF-7细胞中MAPK信号通路，GAP处理MCF-7细胞后，能够显著降低p-ERK蛋白表达水平，显著增加p-p38蛋白的表达水平，其中500μg/mL处理组显著高于其他各组；GAP处理后显著增加p-JNK蛋白的表达水平，其中250μg/mL显著高于其他各组。
结论：GAP通过MAPK/ERK信号通路激活MCF-7细胞产生抗肿瘤作用。本研究不仅揭示了树舌多糖发挥抗肿瘤作用的机制，也为树舌多糖抗肿瘤调节功能的研究提供一定的实验基础和理论依据。
研究方法：使用化学试剂法检测GAP中化学组成成分，高效液相法检测GAP的分子量与单糖组成，使用红外光谱分析GAP组成基团。使用MTT法检测GAP对MCF-7细胞增殖抑制的影响，结晶紫染色观察细胞形态，Hoechst33258实验观察细胞核变化，细胞划痕实验观察细胞侵袭能力。MDC染色检测细胞自噬小泡，免疫荧光检测自噬标志荧光蛋白LC3表达，荧光定量PCR检测自噬相关因子LC3、Beclin-1和mTORmRNA表达水平，AnnexinV-FITC/PI双染检测GAP对MCF-7细胞凋亡的影响。Westernblot法检测自噬和凋亡相关蛋白β-Actin、LC3、Beclin-1、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK表达水平。
实验结果如下：
1.实验所需树舌多糖GAP包含三种不同分子量的多糖，其分子量分别为6.36×105Da、4.25×105Da和2.53×105Da；GAP由鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成，其比例为1∶22∶16.1∶3.2；红外光谱分析显示，GAP含有β-呋喃糖等结构。
2.MTT结果表明GAP能够以剂量和时间依赖性方式抑制MCF-7细胞的增殖，且对人正常乳腺上皮细胞MCF-10A毒性较小。使用结晶紫染色法观察细胞形态、细胞划痕法观察细胞迁移率、Hoechst33258染色法观察细胞核变化，一系列形态学研究结果表明：GAP能够诱导MCF-7细胞形态变化、细胞边缘发生羽化、细胞迁移能力下降、染色质发生固缩，同时能降低MCF-7细胞存活率。
3.MDC染色法检测自噬小泡，表明GAP可以诱导MCF-7细胞发生自噬，免疫荧光分析GAP可以诱导细胞发生自噬，并检测到LC3免疫荧光斑点，实时荧光定量PCR和Westernblot结果表明自噬相关标志物LC3-II、Beclin-1的基因和蛋白表达水平均上调；GAP中加入自噬晚期抑制剂CQ显著提高了LC3-II的蛋白表达水平。
4.流式细胞术分析表明GAP增加MCF-7细胞凋亡细胞比例,Westernblot法检测凋亡相关蛋白表达情况，结果表明，Bax/Bcl-2蛋白表达量上升，Caspase-3、Caspase-9蛋白表达量均随GAP浓度的升高而提高，说明GAP可以诱导MCF-7细胞凋亡。
5.GAP能够激活MCF-7细胞中MAPK信号通路，GAP处理MCF-7细胞后，能够显著降低p-ERK蛋白表达水平，显著增加p-p38蛋白的表达水平，其中500μg/mL处理组显著高于其他各组；GAP处理后显著增加p-JNK蛋白的表达水平，其中250μg/mL显著高于其他各组。
结论：GAP通过MAPK/ERK信号通路激活MCF-7细胞产生抗肿瘤作用。本研究不仅揭示了树舌多糖发挥抗肿瘤作用的机制，也为树舌多糖抗肿瘤调节功能的研究提供一定的实验基础和理论依据。