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黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bunge的干燥根,是我国重要的常用大宗中药材之一。黄芪中主要化学成分包括皂苷、黄酮、多糖等,其中黄芪甲苷是代表性活性成分之一。中国药典以黄芪甲苷为黄芪质量标准指标成分。现代药理学研究显示,黄芪甲苷具有心脏正性肌力、抗病毒性心肌炎、神经保护、抗皮肤表皮细胞衰老等作用,具有重要的药用价值。中国药典以黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷为指标成分,建立了质量标准,并规定黄芪药材按干燥品计算,含黄芪甲苷(C41H68O14)不得少于0.040%,含毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C22H22O10)不得少于0.020%。
黄芪主要分布于我国西北生态脆弱区域,是一种重要的固沙植物,对黄芪野生资源的无限制采掘,将加剧该地区生态系统的恶化,导致沙尘暴愈演愈烈。目前已有以黄芪甲苷单体为原料研究开发一类中药新药,且已进入临床试验阶段。黄芪中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷的含量均很低,其单体化合物制备的产率更低,很显然,以单体化合物为原料进行药物的大规模生产,更会加剧黄芪资源的消耗。
应用现代生物技术获得预期高产黄芪甲苷的黄芪优良品种,缓解黄芪甲苷市场需求对黄芪野生资源的过度依赖,对黄芪的资源开发和可持续利用,以及生态环境的保护都具有巨大的促进作用。本文应用基因工程方法,进行了转基因黄芪研究,获得了转基因黄芪植株,并利用转基因黄芪毛状根开展了转入基因对黄芪次生代谢调节作用的初步研究,为黄芪活性成分黄芪甲苷的进一步开发奠定了基础。
我们选择黄芪种子萌发一周后的子叶和下胚轴为外植体,通过愈伤组织的诱导和再分化,成功构建并优化了黄芪植株再生系统。通过L16(45)正交实验,以愈伤组织诱导率、出芽率为指标,对膜荚黄芪子叶和下胚轴植株再生能力进行了比较研究。实验结果表明子叶和下胚轴均能诱导出不定芽,但以下胚轴为佳。下胚轴在MS+BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L分化培养基上再生芽诱导率达75%。生根培养基为MSOH,有别于文献报道的生根培养基,表明将MS基本培养基中NH4NO3更换为水解酪蛋白能促进根的再生。
在建立的黄芪植株再生体系基础上,以黄芪下胚轴为外植体用含ugp和gbss双基因的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404进行遗传转化,经过预培养、共培养、抗性筛选培养后进行再生芽诱导培养,得到的再生植株经PCR鉴定,获得了5株转ugp和gbss双基因的黄芪再生植株。
同时,在前期获得的转ugp和gbss双基因的黄芪毛状根工作基础上,开展了转基因对黄芪毛状根次生代谢调控作用的研究。构建了仅带有卡那霉素抗性基因(nptⅡ)的表达载体(称之为空载体pBI-NO-GUS),并将pBI-NO-GUS与同时带有nptⅡ基因和gus基因的pBI121分别转入发根农杆菌LBA9402,再分别侵染黄芪外植体,经分子生物学鉴定,证实获得对照黄芪毛状根9株,转gus基因毛状根10株。
HPLC-ELSD结果表明对照黄芪毛状根中黄芪甲苷含量为野生型黄芪毛状根3倍;转gus基因黄芪毛状根黄芪甲苷含量为野生型毛状根的5.4倍,为对照毛状根的1.8倍;转ugp和gbss双基因的黄芪毛状根中黄芪甲苷含量为野生型毛状根的6倍,为对照毛状根的2倍。UPLC-MS图谱显示转gus基因、转ugp和gbss双基因毛状根、对照毛状根与野生型毛状根、原药材相比较,皂苷类次生代谢产物种类均有不同程度增加,其中转gus基因、转ugp和gbss双基因毛状根中黄芪皂苷Ⅳ的原生苷如黄芪皂苷A等同系物的含量也有大幅度提高。以上实验结果说明:nptⅡ基因以及gus、ugp、gbss基因均能促进黄芪毛状根中皂苷类次生代谢产物的生物合成。
以上研究为黄芪皂苷类系列成分的研究、开发利用奠定了基础。