CLARITY技术构建肝脏透明化模型及技术相关应用

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目的:探索一种基于CLARITY技术的快速肝组织透明化手段,通过条件优化对肝硬化动物模型进行免疫荧光标记三维成像,并基于该技术开发一种石蜡切片的抗体洗脱术。  方法:(1)水凝胶灌注大鼠,取出肝脏待水凝胶凝固后切为1mm薄片。切片随机分为两组,对照组采用常规被动脂质清除法处理,实验组置于特制电泳装置中,在外加电场条件下洗涤脂质,通过提高电泳温度并量化组织透明度,探索最优肝透明化条件。  (2)使用肝透明优化条件对DEN诱导的大鼠肝硬化模型进行脂质清除,利用多种大鼠器官组织探索免疫荧光标记成像条件,对大鼠肝硬化模型组织实施激光共聚焦显微镜扫描三维成像。  (3)将CLARITY技术的水凝胶固定、脂质清w除和抗体洗脱特性应用于石蜡切片,探索石蜡切片的透明化方法的最佳条件,进行抗体洗脱,并与常规酸洗脱进行对比。通过对比免疫荧光标记切片洗脱前后荧光信号变化及积分荧光强度测定来确定抗体洗脱效果。  结果:(1)实验组在12V电压下37℃电泳48h时肝切片相对透明度达到最高并保持至96h,随后相对透明度开始下降,而在48h电泳清除脂质后提高温度继续电泳48h,肝组织切片相对透明度可进一步提高且对照组脂质清除速度明显低于实验组。  (2)通过组织透明化处理成功标记了大鼠肾和脑中的正常的组织结构(基底膜和星形胶质细胞)的空间分布情况。大鼠肝硬化模型通过病理检验证明诱导成功,激光共聚焦显微镜扫描三维成像成功显示了透明化肝硬化组织的血管、假小叶和肝细胞在空间结构上的分布和关系。  (3)4um的组织切片、水凝胶固定加上阳离子防脱载玻片的使用可以增强石蜡切片对洗脱的耐受。经过透明化步骤处理的石蜡切片使用4%SDS在60℃条件下可以获得最佳的抗体洗脱效果,效果显著优于常规酸洗脱方式,即洗脱后切片平均积分荧光强度下降最多,且抗体复染效果良好。  结论:肝组织切片在12V电压下37℃电泳48h再辅以52℃电泳48h可以实现较快速的脂质清除。使用肝快速透明化手段处理DEN诱导的大鼠肝硬化组织,通过激光共聚焦显微镜扫描成像可以显示肝硬化组织的高分辨精细结构在三维空间的位置关系和分布。CLARITY技术与石蜡切片具有良好的吻合性,对石蜡切片进行透明化处理可以使切片经过免疫荧光标记后再进行反复的抗体洗脱复染,且能保护组织的形态结构和抗原结合位点不发生改变。
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