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本文对腾冲嗜热菌Thermoanaerobacter tengcongensis MB4和嗜热栖热菌Thermus thermophilus TC11S的耐热α-葡萄糖苷酶进行了基因克隆、酶学表征、定向进化和热稳定性的研究。论文取得的主要结果有：
(1)对T.tengcongensis MB4耐热α-葡萄糖苷酶基因TtgluA进行氨基酸序列分析显示其属于familyⅡα-葡萄糖苷酶和糖苷水解酶家族GH31，并与来自Thermoanaerobacter sp.X514，T.pseudethanolicus和T.ethanolicus的α-葡萄糖苷酶具有高的相似性，分别为79％、79％和78％。
(2)利用PCR方法克隆到了基因TtgluA并在大肠杆菌中表达并纯化了重组TtGluA，其单体89 kDa，活性状态下为三聚体；水解反应最适温度60℃，最适pH5.5；在50℃、60℃和65℃的半衰期分别为5小时、2小时和50分钟；Ag+和H2+可引起TtGluA的不可逆变性，而Pb2+部分抑制TtGluA活性；TtGluA对尿素和SDS具有较好的耐受性；Tris可以抑制TtGluA的活性；TtGluA以外切方式专一水解含有α-1，4-葡萄糖苷键的寡糖底物，可微弱水解环状糊精；TtGluA对麦芽糖具有最高活性，比活力为3.26 units/mg，Km和kcat分别为6.31 mM和253.53s-1；其对底物的优先选择性为：麦芽三糖>麦芽五糖>麦芽糖>麦芽四糖>pNPG。TtGluA是第三个报道的来自Thermoanaerobacter属细菌的α-葡萄糖苷酶，其性质与已报道的另两个分别来自T.thermohydrosulfuricus DSM567和T.thermosaccharolyticum DSM571的α-葡萄糖苷酶有较大差别。
(3)当底物麦芽糖的浓度大于50 mM时，TtGluA具有较高的转糖苷活性。HPLC分析以200mM麦芽糖为底物反应10小时以上时产物中只有异麦芽糖、异麦芽三糖和异麦芽四糖，因此rtGluA可特异性产生α-1，6-葡萄糖苷键的异麦芽寡糖。通过HPLC计算，在反应16小时约53％的麦芽糖被转化成异麦芽寡糖，因此TtGluA具有较高的转糖苷效率。在转糖苷作用中特异性产生异麦芽寡糖的α-葡萄糖苷酶还未见报道，因此TtGluA在糖苷水解酶转糖苷机制的研究及工业生产低聚异麦芽寡糖中具有潜在的理论研究和应用价值。
(4)通过序列比对分析和定点突变得到四个单位点脯氨酸替代突变体：L152P、N208P、K285P和T430P，突变体L152P、K285P和T430P的热稳定性有了明显的提高，三个突变体的T5015值分别为75℃、83.5℃和75℃，比野生型TtGluA分别升高了20℃、10.5℃和20℃。而N208P的T5015值为72.5℃，比野生型降低了0.5℃。圆二色谱实验结果和SWISS-MODEL模拟三维结构分析并结合脯氨酸替代原理，这三个热稳定性提高的突变很可能是由于脯氨酸的替代降低了loop环的柔性，同时(或)增加了区域内的疏水性作用，从而稳定了蛋白的高级结构。结果证明了脯氨酸对于TtGluA热稳定性的重要性，同时也说明了loop环在TtGluA热稳定中的重要作用。
(5)对T.tengcongens MB4α-葡萄糖苷酶TtGluB基因进行了序列分析，显示其属于糖苷水解酶GH31家族，与来自B.licheniformis ATCC14580的糖苷水解酶和B.halodurans C-125的葡萄糖苷酶的相似性最高，均为51％，与TtGluA的相似性为31％。表达和纯化了重组TtGluB，其最适反应温度为90℃，最适反应pH5.0;在90℃保温15分钟后仍有50％的残余酶活，热稳定性较好；Ag+和Hg2+可引起TtGluB的不可逆变性，Ni2+、Co2+、Sn2+和Fe2+可部分使TtGluB失活。TtGluB与TtGluA具有不同的序列和酶学性质，可能在T.tengcongens MB4的糖代谢中起着不同的作用。
(6)从云南腾冲热泉样品筛选得到一株在95℃对pNPG仍具有高水解活性的α-葡萄糖苷酶产生菌株TC11S，其16srDNA序列显示其与Thermus thermophilusHB2716srDNA序列具有99.5％相似性。其α-葡萄糖苷酶基因TthAg与T.thermophilus HB27的α-葡萄糖苷酶基因大小相同，但有11个碱基不同，导致4个氨基酸的差异，属于糖苷水解酶GH13家族，与来自T.thermophilus HB8和Bacillusj flavocaldarius的oligo-1，6-葡萄糖苷酶以及T.caldophilus的α-葡萄糖苷酶相似性最高，分别为89％、89％和88％。重组TthAG单体分子量为59 kDa，活性TthAG在溶液中为三聚体；其最适反应温度90℃，最适pH5.0；在70℃可稳定10小时以上，在80℃和90℃的半衰期分别为3.5小时和2.5小时；pb2+对其活性有19％的激活，其他金属离子和EDTA对其活性都有较明显的抑制作用；TthAG可水解蔗糖、海藻糖和异麦芽寡糖等以及pNPG，不水解聚糖如淀粉、糊精和糖原等；其最适底物为pNPG，比活力为288.96 units/mg，Km和kcat分别为0.48mM和658.60 s-1；序列比对和定点突变分析显示，197位和326位的天冬氨酸以及264位的谷氨酸为TthAG的活性位点：当高浓度(300mM)的蔗糖和海藻糖作为底物时，TthAG具有转糖苷作用。TthAG与T.thermophilus HB27α-葡萄糖苷酶在分子量、热稳定性、底物水解效率、金属离子对酶活影响等方面都有所不同。
(7)利用易错PCR和MEGAWHOP方法构建了TthAG基因的随机突变表达文库，建立了自诱导(auto-induction)表达条件下热稳定性提高突变体和最适反应温度改变突变体的筛选方法。对其中约2，700个克隆子进行了热稳定性的筛选，得到了两个热稳定性提高的突变体Q10Y和V198A。Q10Y的T5015值为97℃，比野生型TthAG高4℃；V198A的T5015值为96℃，比野生型高3℃；Q10Y的最适反应温度分别为70℃，比野生型分别降低了20℃；两个突变体在其最适反应温度下测定对pNPG的酶活分别为野生型的82％和40％；动力学参数实验显示Q10Y对pNPG底物的结合没有影响，但是却降低了其水解的速率；V198A突变不但降低了酶对底物的结合能力，而且降低了其水解效率。
(8)对TthAG的Q10位点进行了饱和突变和三维结构模拟，分析了此位点对TthAG热稳定性的影响。结果显示Q10Y的突变在原有位置很可能增加了一个氢键，同时突变又增强了Q10位点与周围5个疏水氨基酸的疏水作用力，两者共同作用提高了TthAG的热稳定性。而V198在TthAG三维结构中的位于一个长loop上，不参与形成氢键。V198与TthAG的活性位点D197及底物结合位点H100距离较近，因此此位点的突变会影响到TthAG的催化活性和底物结合。根据V198A的突变结果和三维结构模拟推测在这个位点疏水作用很可能与TthAG热稳定性相关，但是不同疏水性氨基酸的突变结果发现疏水作用的改变并不影响TthAG的热稳定性，因此对于V198位点的突变究竟如何影响TthAG的热稳定性还不明确。