论文部分内容阅读
目前养殖鱼类细菌性疾病频繁暴发，对水产养殖业造成了很大威胁。在病害防治方面，渔用疫苗具有安全、环保等优点，己成为重要的研究方向之一，具有重要的实际应用价值。然而，由于病原菌种类繁多，针对单种病原菌逐一研制疫苗，必然存在研发周期长、免疫次数多、对动物正常生活干扰大等问题，难以在实际生产中应用。若以多种病原菌共同的保护性抗原成分制备疫苗，则有望做到应用一种疫苗防治多种病原菌引发的疾病，既大大降低疫苗开发成本和简便免疫操作，又能有效地扩大养殖鱼类疾病的防治范围。本研究利用GenBank数据库，参考了己知鳗鲡病原菌，成功地筛选到3株鳗鲡主要病原菌的共同外膜蛋白基因片段，研究表明其重组表达产物具有良好的免疫原性和免疫保护作用。主要内容和成果如下：
1.不同病原菌共同外膜蛋白基因片段的筛选。本文广泛分析了GenBank数据库中大量鱼类病原菌的基因序列，从中筛选到7株病原菌的共同外膜蛋白基因片段，其表达产物经DNAstar5.01软件预测发现具有良好的免疫原性。设计扩增该片段的特异性引物，对本课题组获得的20株养殖鳗鲡主要病原菌进行扩增，成功地筛选到3株病原菌含有共同外膜蛋白基因片段，1株温和气单胞菌，2株不同血清型的嗜水气单胞菌。3株鳗鲡病原菌共同外膜蛋白基因片段的大小均为747bp，核苷酸序列相似性为100％，在GenBank数据库中的登录号分别为FJ437029、FJ437030和FJ437031。若继续扩大病原菌筛选种类和数量，还有望获得更多病原菌含有该共同外膜蛋白基因片段。
2.共同外膜蛋白基因片段重组质粒的构建及重组表达产物的获得。将扩增到的3株鳗鲡病原菌共同外膜蛋白的PCR产物，经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与表达载体pGEX-2T-His连接，构建重组表达载体，转化到宿主菌Escherichia coliBL21(DE3)中，并通过菌落PCR、质粒酶切及序列测定等方法鉴定重组质粒。优化诱导时的起始菌液浓度、IPTG浓度、诱导温度及诱导时间等条件后发现，在菌体浓度OD600=0.6、0.1 mM的IPTG、37℃诱导7 h条件下，重组外膜蛋白表达量最高，约占总菌体蛋白含量的20％以上，占包涵体蛋白含量的40％以上。利用Sepharase6 Fast Flow亲和介质、(A)KTApurifier-100蛋白质纯化系统及透析法获得了纯度大于98％的复性后的重组共同外膜蛋白rOmp-G。
3.重组外膜蛋白的免疫原性分析。将重组共同外膜蛋白rOmp-G免疫新西兰大白兔，获得了效价为1∶6400的特异性抗血清(S-rOmp-G)；3株病原菌(B10、B27、B33)与该血清S-rOmp-G产生的凝集效价分别为1∶800，1∶1600和1∶800；同时三株病原菌的兔抗血清(S10、S27、S33)与rOmp-G的凝集效价分别为1∶400、1∶400和1∶1600；此外，Western-blot免疫印迹分析发现三株病原菌的鳗鲡抗血清均能有效识别rOmp-G。结果表明：重组共同蛋白rOmp-G具有良好的免疫原性，并在3株病原菌中具有高度的保守性。
4.重组外膜蛋白的免疫保护效果评价。将重组共同外膜蛋白(rOmp-G)免疫欧洲鳗鲡后，发现rOmp-G能够使鳗鲡在3株病原菌(B10、B27、B33)感染时分别产生75％、50％和70％相对免疫保护率。初次免疫注射后第14天和第21天，免疫组鳗鲡特异性抗体效价均为1∶800，第28天上升到1∶1600；免疫组鳗鲡的白细胞吞噬活性在试验期间均显著高于对照组(P＜0.05)；免疫组鳗鲡的血清溶菌酶活力在第14天和第21天显著高于对照组(P＜0.05)。结果表明：重组共同外膜蛋白(rOmp-G)能够有效提高鳗鲡细胞免疫和体液免疫应答水平，并能有效增强机体同时抵抗多种病原菌的能力。因此，利用rOmp-G作为基因工程亚单位疫苗的候选成分，有望做到应用一种疫苗防治多种病原菌引发的疾病，从而为降低疫苗开发成本、简便免疫操作及有效的扩大养殖鱼类疾病的防治范围提供新的途径。