Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1中2-氯硝基苯代谢基因簇的表达模式研究

来源 :中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ahzhangxz
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二十世纪以来,硝基芳烃化合物被广泛应用于化学中间体、炸药、农药和染料的工业生产中,并由此引发了严重的水体和土壤污染。由于苯环的稳定性以及硝基的吸电子作用,该类化合物化学性质较为稳定且易在环境中长期积累,具有生殖毒性、致突变、致畸、致癌等特性,严重威胁人类的健康和生存环境。目前已经分离到多株微生物能够分别完全矿化多种硝基芳烃污染物并作为唯一的碳源、氮源和能源生长。这为硝基芳烃污染的生物治理和生物修复提供了可能。 2-氯硝基苯(2CNB)的代谢途径已经研究的比较清楚,其代谢第一步与其他很多经典的革兰氏阴性菌中硝基芳烃的代谢类似,都是通过nag家族的双加氧酶(是指类似于Ralstonia sp.strain U2菌株中萘双加氧酶NagAaAbAcAd的双加氧酶,如萘、硝基苯、2-硝基甲苯、2,4-二硝基甲苯等的双加氧酶)家族的酶催化的双加氧反应。与其他硝基芳烃的降解基因簇不同的是,2CNB降解基因簇由nag家族的双加氧酶和3-氯邻苯二酚拼接而成,在基因簇中丧失了其他nag家族双加氧酶基因簇的都具有的调控蛋白,因此有必要探究2CNB降解基因簇是如何表达的。  本文研究了Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1菌株中2CNB降解基因簇的表达模式。本研究发现,2CNB双加氧酶基因为组成型表达,而不是像其他nag家族双加氧酶那样受水杨酸的诱导。另外,反转录PCR证实,2CNB代谢途径所有编码基因均在同一个转录单位上。该降解基因簇中共发现3个启动子,其中2个为中间启动子。P1启动子位于基因簇的最上游,驱动整个基因簇的表达,P2和P3启动子在基因簇的中游,驱动基因簇下游的双加氧酶氧化酶组分的表达。其中,P3启动子是其中最强的一个,其活力约为P1的60倍或者P2的30倍。基因簇在表达时,位于上游的3-氯邻苯二酚邻位开环途径的相关基因表达量渐次降低,而编码到位于下游的2CNB双加氧酶氧化酶组分大亚基的基因cnbAc时,表达量突然上升。位于上游的cnbC和位于下游的cnbAc基因的转录起始位点位置与启动子P1和P3吻合,这说明位于下游的cnbAc基因表达量的突然上升是启动子P3的作用。对P3启动子进行序列分析,发现其-35区由18 bp的直接重复序列连接形成,对连接区域进行点突变,对P3启动子的活力有显著影响。另外还有来源于菌株Acidovorax sp.strain JS42质粒pAOVO02上132bp长度的序列也对P3启动子的活力有一定增强作用。本研究对2CNB降解基因簇表达模式的探索,有助于我们更加深刻的理解细菌如何迅速通过表达系统的进化来表达关键的代谢酶类,以适应新的合成化合物。探讨了2CNB双加氧酶催化2CNB双加氧过程中的代谢中间物,以及进行了该双加氧酶通过对茚的生物转化生产抗艾滋病药物的手性中间体的初步探索。
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