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目的:根据目前肝癌细胞起源的相关理论——肝内干细胞“成熟受阻”异常分化导致肝癌的发生及氧化损伤与肿瘤的密切关系,探讨骨髓源性肝脏干细胞在氧化损伤导致的紊乱的肝再生微环境下的增殖和分化;同时进一步探讨方剂槲芪散(HQS)干预肝癌前病变的发生、发展的机制。
方法:体内实验:取80g左右体重的雄性Wistar大鼠的股骨和胫骨,用PBS冲洗骨髓,按密度梯度离心法原代分离培养MSCs,纯化至第3代时进行MSCs的鉴定,选取CD34、CD44、CD45和CD90作为表面标志,用流式细胞术检测这几种标志物的表达。用绿色荧光蛋白(GFP)作为追踪标记物将MSCs进行标记。将大鼠分为正常组(常规饲养)、模型组(PH+DEN+2-AAF)、模型+MSCs移植组(PH+DEN+2-AAF+MSCs)、肝大部切除+MSCs移植组(PH+MSCs)、槲芪散(HQS)治疗组(PH+DEN+2-AAF+MSCs+HQS)、槲寄生总碱(MA)治疗组(PH+DEN+2-AAF+MSCs+MA)。运用经典的Solt-Farber二步法,以二乙基亚硝胺(DEN)为致癌剂,2-乙酰氨基芴(2-AAF)为促癌剂建立大鼠肝癌前病变模型,行肝大部切除术后,在剩余肝脏选择不同部位表面注射经GFP标记好的MSCs,治疗组于肝大部切除术后1周开始经胃饲给槲芪散及槲寄生总碱持续至实验结束,连续给药4周。第9周后取材。采用组织化学方法检测肝脏组织中γ-谷氨酰转肽酶活性的表达;WesternBlot的方法检测肝脏组织中甲胎蛋白的表达;用免疫荧光化学的方法检测经GFP标记的MSCs在肝脏中的表达;用高分辨率超声影像系统检测大鼠肝脏血流的变化;用电子自旋捕获仪检测大鼠肝脏内的自由基。体外实验:取经过鉴定的三代的MSCs在不同的培养条件下进行培养,培养条件及分组为:A、对照组(MSCs)B、生长因子诱导组(MSCs+GF)C、过氧化氢刺激组(MSCs+GF+H2O2)。分别在细胞培养的第7天、14天、21天、28天用RT-PCR的方法检测各组细胞的ALB、AFP、CK18mRNA的表达。用免疫细胞化学的方法检测细胞γ-GT的表达,用Schiff染色的方法检测细胞DNA含量,用流式细胞仪检测非整倍体细胞。
结果:体内实验:原代提取MSCs,生长方式符合MSCs的特点,其表面标记表达的结果是:CD90(+)、CD44(+)、CD34(-)和CD45(-)。GFP标记MSCs的结果:镜下可见多数细胞呈GFP阳性。在正常组和肝大部切除+MSCs移植组中几乎无γ-GT阳性灶出现,只在汇管区有少量表达;模型组和模型+MSCs移植组肝组织中出现大量散在的γ-GT阳性灶。正常组及肝大部切除+MSCs移植组中肝细胞基本无AFP的表达,模型组及模型+MSCs移植组中表达明显增多(P<0.05)。模型+MSCs移植组肝脏中找到有GFP阳性的细胞。与正常组相比模型组与模型+MSCs移植组大鼠肝脏门静脉腔径及血流速度增加,肝静脉腔径及血流速度减小。模型+MSCs移植组肝脏内自由基增加。体外实验:生长因子诱导组及过氧化氢刺激组细胞有ALBmRNA、AFPmRNA及CK18mRNA的表达。过氧化氢刺激组细胞AFPmRNA、CK18mRNA的表达、γ-GT的表达、DNA含量及非整倍体细胞均高于生长因子诱导组(P<0.05)。
结论:体内实验:骨髓细胞移植模型成功,骨髓间充质干细胞可能参与了肝癌前病变的形成和发展,肝癌前病变时肝脏内活性氧增多。体外实验:骨髓间充质干细胞在向肝系细胞分化的过程中受到小剂量过氧化氢的刺激有过度增殖和恶性转化的趋势。