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背景
化疗药物在肿瘤组织中的递送一直是肿瘤药物治疗的一大挑战。耐药性的形成乃至治疗失败与药物分布不均密切相关。而药物的渗透又由药物本身粒径大小以及肿瘤特殊的微环境所决定。粒径过小的药物容易被肾脏清除，而粒径过大，则容易沉积在肝脏等器官，产生系统毒性。加之肿瘤血管发育不成熟，肿瘤内杂乱迂曲的血管分布，过高的肿瘤间质液压以及缺氧区的存在等问题共同导致了化疗药物在肿瘤中递送受限。因此，克服药物在肿瘤中递送困难这一难题，寻找新的治疗手段，如何增强肿瘤组织的药物渗透性，是解决肿瘤化疗困难的关键。
超声联合微泡作为一项新颖的非侵入性的技术，可能改变血管的渗透性，在实现药物在靶组织广泛分布的同时，减少了正常组织不必要的药物暴露。微泡作为空化核，可显著增强对超声能量的吸收，降低超声空化阈值，在超声波作用下发生空化效应对血管内皮造成影响。微泡在较低声压下可发生稳态空化，振荡的气泡靠近血管壁，其产生的剪切力和“推”“拉”作用力对血管壁造成损伤；超声能量升高到一定程度，微泡发生瞬态空化，爆破的瞬间产生的高温、微射流、冲击波等作用于临近的血管壁，可产生包括装胞吞作用，开窗，通道形成，紧密连接开放等破坏行为，从而增加了药物等颗粒的递送，这就为肿瘤的药物治疗带来了新的希望。已有研究表明高声压超声联合微泡治疗后，能阻断肿瘤血流灌注，血管内血栓形成、细胞间水肿。在血管内血栓阻断肿瘤血流灌注期间，药物也就无法随血流充盈整个肿瘤组织，治疗效果随之减弱。且超声能量越大，亦会损伤靶区周围的正常组织。因此，在损伤血管壁以达到增加血管壁通透性的研究中，多使用低声压。力求在不损伤靶区周围正常组织以及阻断肿瘤血流灌注的前提下，实现药物的更多渗透。
基于超声联合微泡所产生的生物效应机制，许多研究者对增强化疗药物在肿瘤中的递送进行了一系列的实验研究，取得了喜人的进展。这些研究或侧重于优化超声参数来增强递送效果，或侧重于研究超声联合微泡对于不同类别物质，如脂质体，基因，病毒载体、药物等递送的影响。其中对于粒径在5-30nm范围的纳米级药物在肿瘤内的积聚和分布情况较少报道。而无论是对大粒径或小粒径分子递送的研究，均较少涉及分子在肿瘤内的分布情况以及肿瘤血管密度对于渗透的影响。
目的
因此，本实验建立皮下浅肌层乏血管移植瘤模型，以伊文思蓝(Evensblue，EB,1.2×3.7nm2)和异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐(Fluorescein isothiocyanate labeled dextran，Fitc-dextran, 500KDa，30.6nm)作为模型药物，运用超声联合微泡对肿瘤进行治疗，观察两种模型药物在肿瘤组织中的渗透情况。研究目的是探索超声联合微泡对于不同粒径分子在肿瘤中分布情况的影响，为今后治疗超声联合微泡增强药物递送的参数选择以及抗癌药物粒径大小的优化提供依据。
方法
(1)健康成年雌性新西兰白50只，制备后肢浅肌层移植瘤兔模型；
(2)实验仪器与材料：超声空化治疗仪，本实验参数为非聚焦脉冲超声波，探头频率1MHz，声压1Mpa，脉冲重复频率为100Hz，占空比1%，脉冲发射时间为9s，间歇时间为3s，治疗时间共10min。脂氟显脂质微泡，超声造影成像所使用微泡剂量为0.01ml/kg，治疗使用剂量为0.2ml/kg。两种示踪剂：依文思蓝溶液(1.2×3.7nm2)，异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐Fitc-dextran(30.6nm)；
(3)实验分组：
第一部分：模型兔随机分成超声微泡组(USMB组8只)、单纯超声组(US组6只)、单纯微泡组(MB组6只)以及空白对照组(BC组6只)，超声联合微泡治疗后即刻经静脉注射依文思蓝液；
第二部分：模型兔随机分成USMB组(6只)、US组(6只)、MB(6只)组以及空白对照组(BC组6只)，超声联合微泡治疗后即刻经静脉注射Fitc-dextran溶液；
(4)CEUS：治疗前以及治疗后各组均进行超声造影，通过PI分析各组治疗前后肿瘤血流灌注情况；
(5)单位质量肿瘤组织内EB的定量分析；
(6)HE染色：予实验兔安乐死后留取肿瘤组织浸泡于多聚甲醛溶液，随后行HE染色，镜下观察各组病理学改变；
(7)IHC:予实验兔安乐死后留取肿瘤组织浸泡于多聚甲醛溶液，随后行IHC染色，镜下观察各组微血管密度MVD的改变；
(8)肿瘤组织行冰冻切片后于荧光显微镜下观察两种示踪剂在肿瘤中的分布情况以及Fitc-dextran的荧光强度分析；
(9)统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行分析，EB溶液标准曲线分析和绘制采用一元线性回归分析程序。各组单位质量肿瘤组织中EB含量、Fitc-dextran荧光强度及MVD值均采用均数±标准差((x)±s)的形式表示。各组间的EB含量、Fitc-dextran荧光强度值及MVD值比较均采用单因素方差分析，多个均数间两两比较采用LSD检验。P＜0.05认为具有统计学意义。
结果
(1)CEUS：视觉观察来看，USMB组整体视觉强度较治疗前稍强，而其余各组未见明显变化。USMB组治疗后PI值较治疗前略有提高；US组治疗后PI较治疗前略有下降。但各组治疗前后PI值相比均无显著性统计学差异，即治疗后肿瘤内部的血流灌注并未出现显著的增加。
(2)EB定量分析：粒径在5-20nm范围的EB以及伊文思蓝-血浆白蛋白复合物，与BC组相比，USMB组的渗透量增加了84.76%，而US组、MB组以及BC组之间的渗透量并无明显差异。Fitc-dextran荧光强度分析：粒径约30.6nm的Fitc-dextran，在肿瘤外1/3区域，相较MB组，USMB组Fitc-dextran的荧光强度增强了69.18%，而US组与MB组之间的荧光强度并无明显差异。在肿瘤中心部位，各组均未能观察到绿色荧光。
(3)HE染色：US组、MB组及BC组的病理结果基本一致，肿瘤组织内可见散在形状不规则的癌巢。巢内可见处在不同增殖期的肿瘤细胞，大小不均，排列密集，核大深染。血管走行紊乱，结构清晰可辨，管壁未见明显损伤，管腔内可见红细胞，血管周围未见明显红细胞溢出。USMB组肿瘤组织内可见散在的局灶状肿瘤细胞坏死，肿瘤细胞体积萎缩变小，核固缩，核碎裂；散在少许损伤区域内微血管充血扩张，管壁结构不完整，可见红细胞从破裂口处溢出到血管周围。
(4)IHC：镜下观察各组IHC切片，USMB组可见散在微血管管壁不完整，但绝大部分血管结构完整。余各组微血管均清晰可见，形态完整。以切片上肿瘤组织长径的中点为整个肿瘤中心，划分出肿瘤内1/2及外1/2区域，经计数，肿瘤内1/2区域MVD为26.45±5.56，而外1/2区域为53.16±6.93。各组微血管计数均无显著性差异。
(5)两种示踪剂的分布情况：EB在荧光显微镜下被激发出红色荧光。肿瘤外1/2区域，各实验组均可见红色荧光广泛分布，弥散成片，以USMB组荧光强度最强。红光强度自边缘往肿瘤中心强度逐渐减弱，分布范围减小。Fitc-dextran于荧光显微镜下呈现为绿色荧光斑点。仅在肿瘤外1/3区域，可观察到绿色荧光斑点分布于血管外区域。USMB组可见绿色荧光斑点渗透距离较大，范围较广，而其余各组可见绿色荧光斑点多贴近于血管边缘分布。自外1/3区域往肿瘤中心，各实验组荧光强度急剧减弱，组间荧光强度无统计学差异。至肿瘤中心部位，各组均未能观察到绿色荧光。
结论
超声联合微泡可增加肿瘤组织的通透性，使不同粒径大小的分子在肿瘤组织内的浓度均增加，继而更多肿瘤细胞暴露于更高剂量的药物，且渗透性随着示踪剂粒径的增大而减小；对于粒径在5-20nm的分子，超声联合微泡可以增加药物在整个肿瘤组织的渗透量，以肿瘤外周组织效果为著；对于粒径在30.6nm左右的分子，超声联合微泡仅可增加其在肿瘤外周的渗透量，对肿瘤中央部位的渗出则无影响。
化疗药物在肿瘤组织中的递送一直是肿瘤药物治疗的一大挑战。耐药性的形成乃至治疗失败与药物分布不均密切相关。而药物的渗透又由药物本身粒径大小以及肿瘤特殊的微环境所决定。粒径过小的药物容易被肾脏清除，而粒径过大，则容易沉积在肝脏等器官，产生系统毒性。加之肿瘤血管发育不成熟，肿瘤内杂乱迂曲的血管分布，过高的肿瘤间质液压以及缺氧区的存在等问题共同导致了化疗药物在肿瘤中递送受限。因此，克服药物在肿瘤中递送困难这一难题，寻找新的治疗手段，如何增强肿瘤组织的药物渗透性，是解决肿瘤化疗困难的关键。
超声联合微泡作为一项新颖的非侵入性的技术，可能改变血管的渗透性，在实现药物在靶组织广泛分布的同时，减少了正常组织不必要的药物暴露。微泡作为空化核，可显著增强对超声能量的吸收，降低超声空化阈值，在超声波作用下发生空化效应对血管内皮造成影响。微泡在较低声压下可发生稳态空化，振荡的气泡靠近血管壁，其产生的剪切力和“推”“拉”作用力对血管壁造成损伤；超声能量升高到一定程度，微泡发生瞬态空化，爆破的瞬间产生的高温、微射流、冲击波等作用于临近的血管壁，可产生包括装胞吞作用，开窗，通道形成，紧密连接开放等破坏行为，从而增加了药物等颗粒的递送，这就为肿瘤的药物治疗带来了新的希望。已有研究表明高声压超声联合微泡治疗后，能阻断肿瘤血流灌注，血管内血栓形成、细胞间水肿。在血管内血栓阻断肿瘤血流灌注期间，药物也就无法随血流充盈整个肿瘤组织，治疗效果随之减弱。且超声能量越大，亦会损伤靶区周围的正常组织。因此，在损伤血管壁以达到增加血管壁通透性的研究中，多使用低声压。力求在不损伤靶区周围正常组织以及阻断肿瘤血流灌注的前提下，实现药物的更多渗透。
基于超声联合微泡所产生的生物效应机制，许多研究者对增强化疗药物在肿瘤中的递送进行了一系列的实验研究，取得了喜人的进展。这些研究或侧重于优化超声参数来增强递送效果，或侧重于研究超声联合微泡对于不同类别物质，如脂质体，基因，病毒载体、药物等递送的影响。其中对于粒径在5-30nm范围的纳米级药物在肿瘤内的积聚和分布情况较少报道。而无论是对大粒径或小粒径分子递送的研究，均较少涉及分子在肿瘤内的分布情况以及肿瘤血管密度对于渗透的影响。
目的
因此，本实验建立皮下浅肌层乏血管移植瘤模型，以伊文思蓝(Evensblue，EB,1.2×3.7nm2)和异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐(Fluorescein isothiocyanate labeled dextran，Fitc-dextran, 500KDa，30.6nm)作为模型药物，运用超声联合微泡对肿瘤进行治疗，观察两种模型药物在肿瘤组织中的渗透情况。研究目的是探索超声联合微泡对于不同粒径分子在肿瘤中分布情况的影响，为今后治疗超声联合微泡增强药物递送的参数选择以及抗癌药物粒径大小的优化提供依据。
方法
(1)健康成年雌性新西兰白50只，制备后肢浅肌层移植瘤兔模型；
(2)实验仪器与材料：超声空化治疗仪，本实验参数为非聚焦脉冲超声波，探头频率1MHz，声压1Mpa，脉冲重复频率为100Hz，占空比1%，脉冲发射时间为9s，间歇时间为3s，治疗时间共10min。脂氟显脂质微泡，超声造影成像所使用微泡剂量为0.01ml/kg，治疗使用剂量为0.2ml/kg。两种示踪剂：依文思蓝溶液(1.2×3.7nm2)，异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐Fitc-dextran(30.6nm)；
(3)实验分组：
第一部分：模型兔随机分成超声微泡组(USMB组8只)、单纯超声组(US组6只)、单纯微泡组(MB组6只)以及空白对照组(BC组6只)，超声联合微泡治疗后即刻经静脉注射依文思蓝液；
第二部分：模型兔随机分成USMB组(6只)、US组(6只)、MB(6只)组以及空白对照组(BC组6只)，超声联合微泡治疗后即刻经静脉注射Fitc-dextran溶液；
(4)CEUS：治疗前以及治疗后各组均进行超声造影，通过PI分析各组治疗前后肿瘤血流灌注情况；
(5)单位质量肿瘤组织内EB的定量分析；
(6)HE染色：予实验兔安乐死后留取肿瘤组织浸泡于多聚甲醛溶液，随后行HE染色，镜下观察各组病理学改变；
(7)IHC:予实验兔安乐死后留取肿瘤组织浸泡于多聚甲醛溶液，随后行IHC染色，镜下观察各组微血管密度MVD的改变；
(8)肿瘤组织行冰冻切片后于荧光显微镜下观察两种示踪剂在肿瘤中的分布情况以及Fitc-dextran的荧光强度分析；
(9)统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行分析，EB溶液标准曲线分析和绘制采用一元线性回归分析程序。各组单位质量肿瘤组织中EB含量、Fitc-dextran荧光强度及MVD值均采用均数±标准差((x)±s)的形式表示。各组间的EB含量、Fitc-dextran荧光强度值及MVD值比较均采用单因素方差分析，多个均数间两两比较采用LSD检验。P＜0.05认为具有统计学意义。
结果
(1)CEUS：视觉观察来看，USMB组整体视觉强度较治疗前稍强，而其余各组未见明显变化。USMB组治疗后PI值较治疗前略有提高；US组治疗后PI较治疗前略有下降。但各组治疗前后PI值相比均无显著性统计学差异，即治疗后肿瘤内部的血流灌注并未出现显著的增加。
(2)EB定量分析：粒径在5-20nm范围的EB以及伊文思蓝-血浆白蛋白复合物，与BC组相比，USMB组的渗透量增加了84.76%，而US组、MB组以及BC组之间的渗透量并无明显差异。Fitc-dextran荧光强度分析：粒径约30.6nm的Fitc-dextran，在肿瘤外1/3区域，相较MB组，USMB组Fitc-dextran的荧光强度增强了69.18%，而US组与MB组之间的荧光强度并无明显差异。在肿瘤中心部位，各组均未能观察到绿色荧光。
(3)HE染色：US组、MB组及BC组的病理结果基本一致，肿瘤组织内可见散在形状不规则的癌巢。巢内可见处在不同增殖期的肿瘤细胞，大小不均，排列密集，核大深染。血管走行紊乱，结构清晰可辨，管壁未见明显损伤，管腔内可见红细胞，血管周围未见明显红细胞溢出。USMB组肿瘤组织内可见散在的局灶状肿瘤细胞坏死，肿瘤细胞体积萎缩变小，核固缩，核碎裂；散在少许损伤区域内微血管充血扩张，管壁结构不完整，可见红细胞从破裂口处溢出到血管周围。
(4)IHC：镜下观察各组IHC切片，USMB组可见散在微血管管壁不完整，但绝大部分血管结构完整。余各组微血管均清晰可见，形态完整。以切片上肿瘤组织长径的中点为整个肿瘤中心，划分出肿瘤内1/2及外1/2区域，经计数，肿瘤内1/2区域MVD为26.45±5.56，而外1/2区域为53.16±6.93。各组微血管计数均无显著性差异。
(5)两种示踪剂的分布情况：EB在荧光显微镜下被激发出红色荧光。肿瘤外1/2区域，各实验组均可见红色荧光广泛分布，弥散成片，以USMB组荧光强度最强。红光强度自边缘往肿瘤中心强度逐渐减弱，分布范围减小。Fitc-dextran于荧光显微镜下呈现为绿色荧光斑点。仅在肿瘤外1/3区域，可观察到绿色荧光斑点分布于血管外区域。USMB组可见绿色荧光斑点渗透距离较大，范围较广，而其余各组可见绿色荧光斑点多贴近于血管边缘分布。自外1/3区域往肿瘤中心，各实验组荧光强度急剧减弱，组间荧光强度无统计学差异。至肿瘤中心部位，各组均未能观察到绿色荧光。
结论
超声联合微泡可增加肿瘤组织的通透性，使不同粒径大小的分子在肿瘤组织内的浓度均增加，继而更多肿瘤细胞暴露于更高剂量的药物，且渗透性随着示踪剂粒径的增大而减小；对于粒径在5-20nm的分子，超声联合微泡可以增加药物在整个肿瘤组织的渗透量，以肿瘤外周组织效果为著；对于粒径在30.6nm左右的分子，超声联合微泡仅可增加其在肿瘤外周的渗透量，对肿瘤中央部位的渗出则无影响。