论文部分内容阅读
研究背景与目的：
脑血流(cerebral blood flow, CBF)的稳定是大脑维持正常生理代谢的基础，当脑血管发生病变而导致脑血流的稳态被破坏，出现脑血流量异常增加或者明显下降时会对大脑功能造成严重且不可逆转的影响。脑血流自动调节(cerebral autoregulation，CA)机制是维持脑血流量稳定的最主要机制。当血压在脑血流自动调节范围内波动时，通过人体自身的调节机制，CBF能维持在恒定状态以保证脑的正常运作。当血压的改变超出脑血流自动调节范围时，CBF会随着血压的增高而升高，随着血压的下降而降低，从而出现高灌注或脑出血的情况。脑血流自动调节的功能因人而异，并且当患者所患的疾病种类、性质不同时，CA的功能也会发生改变。在以往的脑血管病治疗中，我们对患者的CA功能考虑不周，从而在血压的精准调控中对血压的调整幅度难以把握，导致患者的病情加重或预后不良。因此，明确脑血流自动调节机制，对临床上患者的治疗及改善预后有重要且积极的意义。
经典的CA理论认为，脑血管阻力(cerebral vascular resistance, CVR)是维持CBF恒定的重要因素。在CA的范围内，当血压升高时，脑血管收缩，血压下降时，脑血管扩张。根据CA的经典理论，只有当灌注压(cerebral perfusion pressure, CPP)为0的时候，CBF才会为0。但是有研究发现，当离体器官灌注时，CPP低于某一阈值时，血流即为0。Burton提出了关于临界关闭压(critical closing pressure, CCP)的概念，即当管壁即将塌陷时的动脉血压。也有研究认为，在正常生理调节下，脑循环的有效下游压是CCP而不是颈内静脉压。CCP是脑血管张力的反应，是CBF为0时，血管即将塌陷时的平均动脉压(mean arterial blood pressure, MABP)。CCP理论认为，在脑血流自动调节范围内，CCP随着血压的改变而改变，从而维持稳定的灌注压及脑血流。血管瀑布理论认为，在CA的调节范围内，CBF的稳定主要取决于MABP与CCP之差，及脑小动脉的阻力。超出CA的范围时，CBF随着血压的波动而改变。研究发现，当MABP改变时，脑内大动脉及软脑膜的血管管径也随之改变。因此我们推测，脑血管阻力不是脑血流自动调节机制的唯一因素，CCP可能也参与了脑血流自动调节的过程。
我们既往的研究已经证实CCP与血压变化的关系，以及脑表面动脉管径在血压改变过程中的变化，本实验主要观察脑实质中微动脉管径在血压改变时的变化。本实验需动态监测小鼠的血压，以往小鼠动态监测血压的方法通常是通过小鼠颈动脉插管法，然而由于本实验中我们要测量脑血流动力学的相关参数，因此不能进行颈动脉插管。为了能保证在不影响脑血流动力学的情况下动态监测血压，我们采取了小鼠股动脉测压法，该方法所测的动脉血压与小鼠颈动脉插管测压法所测的血压值高度相关，无统计学差异，故小鼠股动脉插管测压法可行且真实可靠。
本课题采用激光多普勒测定相应的CA范围，双光子共聚焦显微镜动态监测脑实质内血管管径的变化，行股动脉插管以监测血压，及梯度改变血压，以评价在脑血流自动调节过程中，脑微动脉管径所起的作用，进一步阐明脑血流自动调节的机制。
研究方法：
一、实验动物及分组
本实验主要分为两部分，第一部分为建立稳定的小鼠股动脉测压模型，采用56只成年雄性小鼠，体重为30~35g(7~8W)，随机分为4组，对照组(n=14)，联合组(n=14)，左股动脉组(n=14)和右股动脉组(n=14)。第二部分，采用53只成年雄性小鼠，随机分为2个大组，4个亚组测量其脑血流量改变及脑血管管径的改变。
二、检测小鼠股动脉测压法的可行性及可靠性
将56只小鼠随机分四组后，分别进行左颈动脉插管、左股动脉插管、右股动脉插管、以及在一只小鼠上同时进行左颈动脉及右股动脉插管，比较他们之间的死亡率、成功率、及操作时间，说明小鼠股动脉插管的可行性。比较采用不同方法所测的收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压，说明股动脉插管测压法所测血压值的可靠性。
三、动脉血压梯度改变及调控方法
降压组经左股动脉插管后缓慢放血于肝素化注射器中，每次回抽0.05ml的血，缓慢降低动脉血压，使血压梯度的从基础血压降至20mmHg。升压组经微泵经小鼠尾静脉缓慢泵入去甲肾上腺素(0.08-1.5μg/ml/Kg/min)以梯度升高血压，使血压缓慢的从基础血压升至140mmHg。血压改变均以10-15mmHg为一梯度，逐级稳定的改变。每一级别都要在血压稳定2-3min后，可以测量脑血流动力学的相关参数。整个实验过程中，保证实验动物体温及Po2、Pco2、pH值稳定。
四、激光多普勒监测右侧大脑中动脉区域脑血流的改变
用戊巴比妥钠(36mg / kg)通过腹腔内注射麻醉小鼠。剃除小鼠颅骨顶部右侧的皮毛，消毒后，在覆盖颅骨的皮肤上开出一个(0.5X0.5cm)的窗口，用牙科固定剂粘好探头固定装置。最后将激光多普的纤维探头置于固定装置中，垂直于右顶骨头的表面放置以监测右侧大脑中动脉(MCA)领域的血流。
五、双光子共聚焦显微镜三维成像
小鼠麻醉后，准备好颅窗，通过小鼠尾静脉将造影剂FITC荧光染料(150ml/Kg)注入。使用TPLSM物镜(Leica，25*水镜)，波长选择绿色荧光激发波长800um，选取一个随机的视野(512*512um)，可见颅窗下充满绿色荧光染料的动静脉。然后采用高分辨率成像，使用Leicao.95数值孔径和25倍放大倍数的水镜。在TCSSP5MP系统(Leica Microsystems，Mannheim，Germany)上使用双通道NDD检测(525/50nm的发射滤波器)获得所有图像。
六、统计学处理
所有资料应用SPSS20.0统计软件和Excel2013办公软件处理。所有数据均进行正态分析，符合正态分布者，用均数和标准差(x?s)描述。采用T检验、方差分析、及相关性分析等方法。P≤0.05表示差异(相关)有统计学意义。
研究结果：
一、小鼠股动脉测压法的建立
在各组之中，左股动脉组的死亡率最低，联合组死亡率最高但均无明显的统计学差异。左股动脉组的成功率最高而联合组的成功率最低，但也都没有统计学差异。在手术时间上，左股动脉插管组、右股动脉插管组，及对照组手术时间(661.44±86.70s，670.33±91.54s，672.36±83.87s，P＞0.05)，均无统计学差异。说明小鼠股动脉插管测压法的可行性。各组血压值的T检验结果显示各组所测血压值均无统计学差异，且联合组中Bland-Altman及相关性分析结果显示，股动脉测压法与颈动脉测压法所测结果的一致性及相关性都非常高，说明小鼠股动脉测压法的可靠性。
二、小鼠脑血流自动调节范围
脑血流量测量组的结果显示，在-30mmHg~+30mmHgΔMABP的范围内，脑血流量的变化率均小于10%，且无统计学差异。在升压亚组中，当平均动脉压增加30?45mmHg时，脑血流量的变化率增加到17.23％，在降压亚组中随着平均动脉压下降30?45mmHg时，变化率达到15.32％。说明小鼠的脑血流自动调节范围为-30mmHg~+30mmHgΔMABP。
三、血压改变时，脑微动脉管径的变化趋势
当平均动脉压得变化在-30mmHg~+30mmHg时，脑皮质微动脉及脑穿支微动脉均没有明显的血管舒缩。在升压亚组中，当平均动脉压增加超过30mmHg时，脑皮质小动脉和穿支小动脉中小动脉管径的变化率具有明显的统计学显着性差异。在降压亚组，变化趋势与升压亚组相似。当平均动脉压降低50mmHg时，脑皮质小动脉和穿支小动脉的动脉直径均有统计学意义。
四、血压变化率与管径变化率的关系
在脑血流自动调节范围内,血压改变时，管径的改变是无明显规律。而在血压变化率与管径变化率的相关性分析中可知，两者之间的相关性大多无统计学意义，除了在升压亚组中平均动脉压升高10?15mmHg时的穿支小动脉的相关性有统计学意义。
五、血压变化率与阻力变化率的关系
相关性分析表明，MABP/MABPc和R4/R4c的比值几乎无相关性，除了在升压亚组中平均动脉压升高10?15mmHg时的穿支小动脉的相关性有统计学意义，其他的均无统计学意义。
研究结论：
1.小鼠股动脉插管测压法监测动脉血压与颈动脉测压法一样可行可靠。
2.小鼠脑血流自动调节范围在-30~+30mmHg△MABP之间。在调节范围以内，脑血流变化较小，超出此范围，脑血流变化随着血压改变而增大。
3.在脑血流自动调节范围内，血压变化时，脑微动脉管径变化不明显，超出此范围后，降压亚组及升压亚组中，微动脉管径均有明显的扩大。说明脑实质微动脉管径在脑血流自动调节的过程中起的作用不大。
4.在脑血流自动调节范围内，动脉血压的改变率与管径变化率及阻力的变化率无明显的相关关系。我们的结果从定量的角度说明了自动调节范围内稳定脑血流、代偿血压的变化主要不是通过微动脉管径或血流阻力改变的途径。
脑血流(cerebral blood flow, CBF)的稳定是大脑维持正常生理代谢的基础，当脑血管发生病变而导致脑血流的稳态被破坏，出现脑血流量异常增加或者明显下降时会对大脑功能造成严重且不可逆转的影响。脑血流自动调节(cerebral autoregulation，CA)机制是维持脑血流量稳定的最主要机制。当血压在脑血流自动调节范围内波动时，通过人体自身的调节机制，CBF能维持在恒定状态以保证脑的正常运作。当血压的改变超出脑血流自动调节范围时，CBF会随着血压的增高而升高，随着血压的下降而降低，从而出现高灌注或脑出血的情况。脑血流自动调节的功能因人而异，并且当患者所患的疾病种类、性质不同时，CA的功能也会发生改变。在以往的脑血管病治疗中，我们对患者的CA功能考虑不周，从而在血压的精准调控中对血压的调整幅度难以把握，导致患者的病情加重或预后不良。因此，明确脑血流自动调节机制，对临床上患者的治疗及改善预后有重要且积极的意义。
经典的CA理论认为，脑血管阻力(cerebral vascular resistance, CVR)是维持CBF恒定的重要因素。在CA的范围内，当血压升高时，脑血管收缩，血压下降时，脑血管扩张。根据CA的经典理论，只有当灌注压(cerebral perfusion pressure, CPP)为0的时候，CBF才会为0。但是有研究发现，当离体器官灌注时，CPP低于某一阈值时，血流即为0。Burton提出了关于临界关闭压(critical closing pressure, CCP)的概念，即当管壁即将塌陷时的动脉血压。也有研究认为，在正常生理调节下，脑循环的有效下游压是CCP而不是颈内静脉压。CCP是脑血管张力的反应，是CBF为0时，血管即将塌陷时的平均动脉压(mean arterial blood pressure, MABP)。CCP理论认为，在脑血流自动调节范围内，CCP随着血压的改变而改变，从而维持稳定的灌注压及脑血流。血管瀑布理论认为，在CA的调节范围内，CBF的稳定主要取决于MABP与CCP之差，及脑小动脉的阻力。超出CA的范围时，CBF随着血压的波动而改变。研究发现，当MABP改变时，脑内大动脉及软脑膜的血管管径也随之改变。因此我们推测，脑血管阻力不是脑血流自动调节机制的唯一因素，CCP可能也参与了脑血流自动调节的过程。
我们既往的研究已经证实CCP与血压变化的关系，以及脑表面动脉管径在血压改变过程中的变化，本实验主要观察脑实质中微动脉管径在血压改变时的变化。本实验需动态监测小鼠的血压，以往小鼠动态监测血压的方法通常是通过小鼠颈动脉插管法，然而由于本实验中我们要测量脑血流动力学的相关参数，因此不能进行颈动脉插管。为了能保证在不影响脑血流动力学的情况下动态监测血压，我们采取了小鼠股动脉测压法，该方法所测的动脉血压与小鼠颈动脉插管测压法所测的血压值高度相关，无统计学差异，故小鼠股动脉插管测压法可行且真实可靠。
本课题采用激光多普勒测定相应的CA范围，双光子共聚焦显微镜动态监测脑实质内血管管径的变化，行股动脉插管以监测血压，及梯度改变血压，以评价在脑血流自动调节过程中，脑微动脉管径所起的作用，进一步阐明脑血流自动调节的机制。
研究方法：
一、实验动物及分组
本实验主要分为两部分，第一部分为建立稳定的小鼠股动脉测压模型，采用56只成年雄性小鼠，体重为30~35g(7~8W)，随机分为4组，对照组(n=14)，联合组(n=14)，左股动脉组(n=14)和右股动脉组(n=14)。第二部分，采用53只成年雄性小鼠，随机分为2个大组，4个亚组测量其脑血流量改变及脑血管管径的改变。
二、检测小鼠股动脉测压法的可行性及可靠性
将56只小鼠随机分四组后，分别进行左颈动脉插管、左股动脉插管、右股动脉插管、以及在一只小鼠上同时进行左颈动脉及右股动脉插管，比较他们之间的死亡率、成功率、及操作时间，说明小鼠股动脉插管的可行性。比较采用不同方法所测的收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压，说明股动脉插管测压法所测血压值的可靠性。
三、动脉血压梯度改变及调控方法
降压组经左股动脉插管后缓慢放血于肝素化注射器中，每次回抽0.05ml的血，缓慢降低动脉血压，使血压梯度的从基础血压降至20mmHg。升压组经微泵经小鼠尾静脉缓慢泵入去甲肾上腺素(0.08-1.5μg/ml/Kg/min)以梯度升高血压，使血压缓慢的从基础血压升至140mmHg。血压改变均以10-15mmHg为一梯度，逐级稳定的改变。每一级别都要在血压稳定2-3min后，可以测量脑血流动力学的相关参数。整个实验过程中，保证实验动物体温及Po2、Pco2、pH值稳定。
四、激光多普勒监测右侧大脑中动脉区域脑血流的改变
用戊巴比妥钠(36mg / kg)通过腹腔内注射麻醉小鼠。剃除小鼠颅骨顶部右侧的皮毛，消毒后，在覆盖颅骨的皮肤上开出一个(0.5X0.5cm)的窗口，用牙科固定剂粘好探头固定装置。最后将激光多普的纤维探头置于固定装置中，垂直于右顶骨头的表面放置以监测右侧大脑中动脉(MCA)领域的血流。
五、双光子共聚焦显微镜三维成像
小鼠麻醉后，准备好颅窗，通过小鼠尾静脉将造影剂FITC荧光染料(150ml/Kg)注入。使用TPLSM物镜(Leica，25*水镜)，波长选择绿色荧光激发波长800um，选取一个随机的视野(512*512um)，可见颅窗下充满绿色荧光染料的动静脉。然后采用高分辨率成像，使用Leicao.95数值孔径和25倍放大倍数的水镜。在TCSSP5MP系统(Leica Microsystems，Mannheim，Germany)上使用双通道NDD检测(525/50nm的发射滤波器)获得所有图像。
六、统计学处理
所有资料应用SPSS20.0统计软件和Excel2013办公软件处理。所有数据均进行正态分析，符合正态分布者，用均数和标准差(x?s)描述。采用T检验、方差分析、及相关性分析等方法。P≤0.05表示差异(相关)有统计学意义。
研究结果：
一、小鼠股动脉测压法的建立
在各组之中，左股动脉组的死亡率最低，联合组死亡率最高但均无明显的统计学差异。左股动脉组的成功率最高而联合组的成功率最低，但也都没有统计学差异。在手术时间上，左股动脉插管组、右股动脉插管组，及对照组手术时间(661.44±86.70s，670.33±91.54s，672.36±83.87s，P＞0.05)，均无统计学差异。说明小鼠股动脉插管测压法的可行性。各组血压值的T检验结果显示各组所测血压值均无统计学差异，且联合组中Bland-Altman及相关性分析结果显示，股动脉测压法与颈动脉测压法所测结果的一致性及相关性都非常高，说明小鼠股动脉测压法的可靠性。
二、小鼠脑血流自动调节范围
脑血流量测量组的结果显示，在-30mmHg~+30mmHgΔMABP的范围内，脑血流量的变化率均小于10%，且无统计学差异。在升压亚组中，当平均动脉压增加30?45mmHg时，脑血流量的变化率增加到17.23％，在降压亚组中随着平均动脉压下降30?45mmHg时，变化率达到15.32％。说明小鼠的脑血流自动调节范围为-30mmHg~+30mmHgΔMABP。
三、血压改变时，脑微动脉管径的变化趋势
当平均动脉压得变化在-30mmHg~+30mmHg时，脑皮质微动脉及脑穿支微动脉均没有明显的血管舒缩。在升压亚组中，当平均动脉压增加超过30mmHg时，脑皮质小动脉和穿支小动脉中小动脉管径的变化率具有明显的统计学显着性差异。在降压亚组，变化趋势与升压亚组相似。当平均动脉压降低50mmHg时，脑皮质小动脉和穿支小动脉的动脉直径均有统计学意义。
四、血压变化率与管径变化率的关系
在脑血流自动调节范围内,血压改变时，管径的改变是无明显规律。而在血压变化率与管径变化率的相关性分析中可知，两者之间的相关性大多无统计学意义，除了在升压亚组中平均动脉压升高10?15mmHg时的穿支小动脉的相关性有统计学意义。
五、血压变化率与阻力变化率的关系
相关性分析表明，MABP/MABPc和R4/R4c的比值几乎无相关性，除了在升压亚组中平均动脉压升高10?15mmHg时的穿支小动脉的相关性有统计学意义，其他的均无统计学意义。
研究结论：
1.小鼠股动脉插管测压法监测动脉血压与颈动脉测压法一样可行可靠。
2.小鼠脑血流自动调节范围在-30~+30mmHg△MABP之间。在调节范围以内，脑血流变化较小，超出此范围，脑血流变化随着血压改变而增大。
3.在脑血流自动调节范围内，血压变化时，脑微动脉管径变化不明显，超出此范围后，降压亚组及升压亚组中，微动脉管径均有明显的扩大。说明脑实质微动脉管径在脑血流自动调节的过程中起的作用不大。
4.在脑血流自动调节范围内，动脉血压的改变率与管径变化率及阻力的变化率无明显的相关关系。我们的结果从定量的角度说明了自动调节范围内稳定脑血流、代偿血压的变化主要不是通过微动脉管径或血流阻力改变的途径。