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研究背景和目的：
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种常见的恶性肿瘤疾病，严重威胁人类的生命和健康，其发病率和死亡率逐年递增，2011年我国结直肠癌的发病率是23.03/10万，是我国发病率位居第4位的常见恶性肿，其死亡率也高达11.11/10万，且在城市发达地区远高于农村地区。与西方国家相比，我国结直肠癌患者的预后生存时间低于西方，由于对癌前病变的筛查不够普及，多数患者延误了早期治疗时机，疾病被发现时已处于中晚期，直接影响患者的预后生存。
癌胚抗原CEA、糖蛋白抗原CA19-9等肠癌相关的肿瘤血清标志物检测的发现和普及，为结直肠癌的诊断和监测提供了非常大的帮助。但随着精准医学理念的提出和不断推进，临床上常用的肿瘤标志物检测的特异性和敏感性已不能满足临床上对肿瘤筛查、诊断和治疗精细化监测的需要。寻求更有意义的血清肿瘤标志一直是肿瘤诊断领域的研究热点。而近年来随着二代测序技术快速发展和应用，液体活检技术逐渐成为一个肿瘤诊断和治疗监测中非常值得期待的有效途径和手段。
循环肿瘤DNA(ctDNA)是液体活检技术的前沿组成部分，对于ctDNA的生物学特性及其检测技术国内外学者已有诸多研究。在人体内的血液和脑脊液中均有ctDNA的存在，由于其不仅来自于正常体细胞代谢的凋亡，而且又来源于循环肿瘤细胞的代谢死亡，可以避免组织病理学检查过程中由于细胞异质性造成的片面性。而对其基因型的分析不仅可以根据突变靶点准确筛选出合适的靶向药物，还可以对肿瘤进展过程中的不同阶段进行基因分型的动态分析，如耐药基因的出现、肿瘤的新突变靶点等，从而提示医生做出对应的合适的临床决策，使精准治疗得以实现。
研究方法:
本研究纳入自2016年7月起在我科初次就诊确诊为结、直肠癌且行手术治疗的患者，通过对其手术切除肿瘤组织标本进行全外显子测序和治疗过程中不同节点(术前、术后3-7天、术后辅助化前、辅助化疗中)血浆ctDNA的动态检测。对测序和ctDNA检测严格质控，得到肿瘤治疗过程中的基因突变分型的动态变化，并严格随访以了解突变基因型相关的疗效和预后。寻找对结直肠癌发生发展起关键作用的基因型突变，同时探索血浆ctDNA作为结直肠癌筛查、诊断、治疗策略、预后评估手段的可能性。
实验结果：
共收集来自7个患者的术中组织样本共8份和外周血标本28份。
1.对7位患者的8份组织样本进行了DNA提取和测序。组织样本测序平均深度为866.03X，根据目前已知的结直肠癌相关基因突变数据库经过探针筛选，得到了可能与结直肠癌疾病相关的47个SNP位点。进一步统计分析发现其中APC、TP53、KRAS、MLL4等4个基因的出现频率较高，且其突变位点均为常见的突变位点。这与现有的结直肠癌发生发展的基因突变谱的研究相符。此外还涉及DDR2、NF1、GNAS、FBXW7、JAK2、C11orf30、PIK3R2等多个基因的SNP改变均可能与结直肠癌相关，这些基因均有与肠癌发生相关的报道。本实验纳入的7例患者均未有遗传性肠癌相关的胚系突变检出也与患者均否认家族史相符。
2.对25份血浆样本和7名患者的白细胞(作为对照)都进行了高通量测序，血浆的测序平均深度为1103.34X，在血浆的检测中，纳入检测的7位患者的6份术前血标本中有4份检出突变基因，而该4名患者的组织术后免疫组化中显示Ki67阳性指数均大于超过40%，而2名检出ctDNA的患者其Ki67阳性指数均小于30%，这说明基线ctDNA可能与患者肿瘤负荷和分裂增殖活跃度密切相关。检测6份术后血标本中(患者6术后血配对异常)只有一例(患者1)检出突变，6份辅助治疗前血标本均为阴性。7份辅助治疗中血标本中6名患者的ctDNA的检测为阴性，患者5的辅助治疗中血检测出体细胞突变。血浆ctDNA检测出的突变位点均在组织测序发现的突变中，且均为变异丰度较高的组织突变位点。目前对所有患者临床治疗过程进行跟踪随访，患者1评价为病情稳定(SD, stable disease)，其余患者目前均未见复发、转移。
3.在4位患者术前检出了ctDNA，4位患者的中3位Ⅱ、Ⅲ期的患者均为根治手术，1位Ⅳ期患者术中发现大网膜可疑转移，术中行大网膜切除，4位患者在手术后到术后辅助治疗前一个月时间内的两次检测中均未再检测出ctDNA。而患者1是一名回盲部腺癌伴肺转移行右半结肠切除术的患者，术中未处理双肺转移灶，其术后血中检测出ctDNA，虽然该患者无术前血ctDNA的检测作为对照，但是其可反映出患者的带瘤生存状态。在术前和术后一月内检出ctDNA的5位患者中，手术清除率与ctDNA的检测符合率达到了100%。
实验结论：
1.ctDNA检测能反映肿瘤组织的部分基因突变类型，可为临床的诊疗过程提供初步线索。
2.结直肠癌患者基线ctDNA可能与患者肿瘤负荷和分裂增殖活跃度密切相关，在分裂增殖较活跃的结直肠癌患者中更易检出ctDNA。
3.结直肠癌患者术后血浆ctDNA的动态监测在评价结直肠癌手术对肿瘤的清除率上有较高的价值，对患者术后.用药指导及预后评估等方面有一定的意义。
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种常见的恶性肿瘤疾病，严重威胁人类的生命和健康，其发病率和死亡率逐年递增，2011年我国结直肠癌的发病率是23.03/10万，是我国发病率位居第4位的常见恶性肿，其死亡率也高达11.11/10万，且在城市发达地区远高于农村地区。与西方国家相比，我国结直肠癌患者的预后生存时间低于西方，由于对癌前病变的筛查不够普及，多数患者延误了早期治疗时机，疾病被发现时已处于中晚期，直接影响患者的预后生存。
癌胚抗原CEA、糖蛋白抗原CA19-9等肠癌相关的肿瘤血清标志物检测的发现和普及，为结直肠癌的诊断和监测提供了非常大的帮助。但随着精准医学理念的提出和不断推进，临床上常用的肿瘤标志物检测的特异性和敏感性已不能满足临床上对肿瘤筛查、诊断和治疗精细化监测的需要。寻求更有意义的血清肿瘤标志一直是肿瘤诊断领域的研究热点。而近年来随着二代测序技术快速发展和应用，液体活检技术逐渐成为一个肿瘤诊断和治疗监测中非常值得期待的有效途径和手段。
循环肿瘤DNA(ctDNA)是液体活检技术的前沿组成部分，对于ctDNA的生物学特性及其检测技术国内外学者已有诸多研究。在人体内的血液和脑脊液中均有ctDNA的存在，由于其不仅来自于正常体细胞代谢的凋亡，而且又来源于循环肿瘤细胞的代谢死亡，可以避免组织病理学检查过程中由于细胞异质性造成的片面性。而对其基因型的分析不仅可以根据突变靶点准确筛选出合适的靶向药物，还可以对肿瘤进展过程中的不同阶段进行基因分型的动态分析，如耐药基因的出现、肿瘤的新突变靶点等，从而提示医生做出对应的合适的临床决策，使精准治疗得以实现。
研究方法:
本研究纳入自2016年7月起在我科初次就诊确诊为结、直肠癌且行手术治疗的患者，通过对其手术切除肿瘤组织标本进行全外显子测序和治疗过程中不同节点(术前、术后3-7天、术后辅助化前、辅助化疗中)血浆ctDNA的动态检测。对测序和ctDNA检测严格质控，得到肿瘤治疗过程中的基因突变分型的动态变化，并严格随访以了解突变基因型相关的疗效和预后。寻找对结直肠癌发生发展起关键作用的基因型突变，同时探索血浆ctDNA作为结直肠癌筛查、诊断、治疗策略、预后评估手段的可能性。
实验结果：
共收集来自7个患者的术中组织样本共8份和外周血标本28份。
1.对7位患者的8份组织样本进行了DNA提取和测序。组织样本测序平均深度为866.03X，根据目前已知的结直肠癌相关基因突变数据库经过探针筛选，得到了可能与结直肠癌疾病相关的47个SNP位点。进一步统计分析发现其中APC、TP53、KRAS、MLL4等4个基因的出现频率较高，且其突变位点均为常见的突变位点。这与现有的结直肠癌发生发展的基因突变谱的研究相符。此外还涉及DDR2、NF1、GNAS、FBXW7、JAK2、C11orf30、PIK3R2等多个基因的SNP改变均可能与结直肠癌相关，这些基因均有与肠癌发生相关的报道。本实验纳入的7例患者均未有遗传性肠癌相关的胚系突变检出也与患者均否认家族史相符。
2.对25份血浆样本和7名患者的白细胞(作为对照)都进行了高通量测序，血浆的测序平均深度为1103.34X，在血浆的检测中，纳入检测的7位患者的6份术前血标本中有4份检出突变基因，而该4名患者的组织术后免疫组化中显示Ki67阳性指数均大于超过40%，而2名检出ctDNA的患者其Ki67阳性指数均小于30%，这说明基线ctDNA可能与患者肿瘤负荷和分裂增殖活跃度密切相关。检测6份术后血标本中(患者6术后血配对异常)只有一例(患者1)检出突变，6份辅助治疗前血标本均为阴性。7份辅助治疗中血标本中6名患者的ctDNA的检测为阴性，患者5的辅助治疗中血检测出体细胞突变。血浆ctDNA检测出的突变位点均在组织测序发现的突变中，且均为变异丰度较高的组织突变位点。目前对所有患者临床治疗过程进行跟踪随访，患者1评价为病情稳定(SD, stable disease)，其余患者目前均未见复发、转移。
3.在4位患者术前检出了ctDNA，4位患者的中3位Ⅱ、Ⅲ期的患者均为根治手术，1位Ⅳ期患者术中发现大网膜可疑转移，术中行大网膜切除，4位患者在手术后到术后辅助治疗前一个月时间内的两次检测中均未再检测出ctDNA。而患者1是一名回盲部腺癌伴肺转移行右半结肠切除术的患者，术中未处理双肺转移灶，其术后血中检测出ctDNA，虽然该患者无术前血ctDNA的检测作为对照，但是其可反映出患者的带瘤生存状态。在术前和术后一月内检出ctDNA的5位患者中，手术清除率与ctDNA的检测符合率达到了100%。
实验结论：
1.ctDNA检测能反映肿瘤组织的部分基因突变类型，可为临床的诊疗过程提供初步线索。
2.结直肠癌患者基线ctDNA可能与患者肿瘤负荷和分裂增殖活跃度密切相关，在分裂增殖较活跃的结直肠癌患者中更易检出ctDNA。
3.结直肠癌患者术后血浆ctDNA的动态监测在评价结直肠癌手术对肿瘤的清除率上有较高的价值，对患者术后.用药指导及预后评估等方面有一定的意义。