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目前世界上有2.7亿人患疟疾，主要发生在撒哈拉以南非洲地区，每年新发病例200万人，引起超过100万人死亡，绝大多数是儿童。在疟疾感染引起的各种临床症状中，脑疟（Cerebral Malaria，CM）引起的神经系统并发症是最主要的死亡原因之一。营养不良影响着发展中国家近20％的人口，在撒哈拉以南非洲地区，有将近三分之一的五岁以下儿童因为营养不良而体重过轻和发育迟缓，低蛋白饮食是造成儿童营养不良的一个主要和常见原因。疟疾感染会降低五岁以下儿童的营养状态，加重儿童营养不良的结局，营养不良也进一步增加疟疾的易感性、发病率和死亡率。
CM是由恶性疟原虫感染的红细胞在脑组织微血管的沉积所引起的一系列并发症。iRBCs和过强的炎症应答是CM发生所必需的两个条件。一般认为是iRBCs结合到微血管内皮上，引起全身性炎症反应，但主要局限于iRBC沉积的部位，包括细胞因子、趋化因子、白细胞（T细胞和中性粒细胞）以及iRBCs参与微血管的病理损伤，促进ECM的发生，免疫病理损伤的发生需要微血管循环或沉积的iRBCs持续刺激。CD4+T细胞产生的IFN-γ促进CD8+T细胞在脑组织的聚集。CD8+T细胞通过一种穿孔素依赖机制来介导CM的发生。尽管中性粒细胞不沉积在脑组织中，但其通过通过增加脑组织中前炎症细胞因子尤其是IL-12的表达水平参与ECM的发生。IFN-γ能够激活一些通路，尤其是IP10/CXCL10。TNF-α能够抵抗疟疾感染，杀伤疟原虫，但血清中高浓度的TNF-α与重症疟疾如CM发生密切相关。TNF-α能够诱导内皮细胞的活化，从而上调一些粘附分子如ICAM-1、CD36和VCAM-1的表达。其中ICAM-1参与iRBCs的粘附，iRBCs粘附在血管壁上会引起内皮细胞凋亡，引起血管通透性的改变及血脑屏障的破坏。TGF-β能够通过增强IL-10的产生水平抑制TNF-α、NO以及IFN-γ的产生，最终可引起机体免疫应答从Th1型转向Th2型。趋化因子能参与中枢神经系统的病理损伤。CXCR3的两个配体CXCL9和CXCL10 mRNA水平高度升高，参与ECM的发生。细胞粘附分子会促进趋化至血管部位的炎症细胞与血管内皮的结合，从而导致细胞在脑部微血管的沉积。疟色素可以活化MMP9基因参与CM的发生。
脾脏中的免疫细胞如树突状细胞(Dendritic cells，DCs)、T细胞和巨噬细胞在控制疟疾感染过程中发挥重要作用。DCs作为重要的抗原提呈细胞，能够捕获抗原，并在向淋巴组织T细胞区移行的过程中逐渐成熟，活化抗原特异性的T细胞。活化的CD4+T细胞通过分泌细胞因子如IFN-γ来促进对疟原虫的杀伤作用。Th1免疫应答在感染早期控制疟疾感染方面具有重要作用，但同时也能引起CM的发生。作为平衡体内免疫应答一群重要细胞，Treg能够通过分泌细胞因子如TGF-β和IL-10以及增加调节分子CTLA-4的表达抑制体内异常或过强的T细胞应答，从而防止自身免疫性反应。疟疾感染时，巨噬细胞可以直接吞噬感染的红细胞，NO和活性氧簇有助于吞噬细胞如巨噬细胞在胞吞病原体之后对病原体的杀伤。
酪蛋白是牛奶蛋白质的主要组成部分，约占总蛋白的80％。作为新生儿生长所需要的氨基酸主要来源之一，酪蛋白饮食在体内会水解为很多功能肽，主要发挥免疫调节和抗菌作用。牛奶饮食尤其是其中的酪蛋白对P.berghei感染结局具有预防作用，酪蛋白经水解之后的多肽能够调节免疫功能，来自αs1-、β-和κ-酪蛋白的肽片段能调节淋巴细胞增殖。然而，也有体外研究表明β-casomorphin-7和β-casokinin-10在高浓度时增强免疫功能，低浓度时抑制免疫功能。阿片样β-酪啡肽等免疫刺激剂能够激活巨噬细胞的吞噬活性，并在T细胞的增殖和成熟过程中发挥重要作用。此外，αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的某些肽片段能抑制丝裂原诱导的人淋巴细胞和外周血单个核细胞的增殖，但在缺少丝裂原时又能刺激淋巴细胞增殖。酪蛋白水解物通过增强ConA诱导的IL-2以及IFN-γ产生来增强Th1免疫应答，但对IL-4和IL-10产生没有影响。为此，本研究通过给C57BL/6小鼠喂食不同含量的酪蛋白饮食后，感染伯氏疟原虫(Plasmodiumberghei ANKA，PbA)建立ECM模型，明确酪蛋白饮食对疟疾感染过程和结局的影响。揭示酪蛋白防止ECM发生的相关机制，并为流行区脑疟儿童免疫干预策略的确立提供新的理论依据。
实验方法:
1、实验动物及模型构建
3-4周龄，雌性C57BL/6小鼠经腹腔感染感染1×106 Pb ANKA寄生红细胞，感染前给予不同酪蛋白饮食饲养一个月。监测小鼠体重和感染率。
2、小鼠血脑屏障通透性检测
1)将各组小鼠静脉注射200μl2％伊文思蓝染料。
2)1h后，心脏灌注生理盐水而至流出清亮液体为准，然后取脑，拍照。
3)将各组小鼠的脑放入离心管中，管内加入1ml甲酰胺，37℃孵育48h。
4)将各管取出，3000rpm离心15min，取上清液200μl，放于96孔板中。
5)630nm检测OD值。
3、免疫组化
脑组织切片标本经4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连结法（即S-p法）进行免疫细胞化学染色:①切片常规烤片，脱蜡，水化;②0.01mol/L柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复3min;③内源性过氧化物酶阻断溶液37℃下孵育15min;④非免疫性动物血清37℃下孵育15min;⑤一抗4℃下孵育过夜，VCAM-1抗体稀释比例均为1∶150;⑥生物素标记的二抗37℃下孵育30min;⑦链霉素亲和素过氧化物酶溶液37℃下孵育30min;⑧新配置的DAB显色液显色5min;⑨苏木素复染，中性树胶封片。各步之间用PBS(PH=7.4)冲洗三次，每次5min。以PBS代替一抗做阴性对照。
4、 Real-time RT-PCR
脑组织Total RNA的提取及反转录:按照说明书Trizol提取脑组织RNA，然后使用分光光度计测定浓度。用PrimeScriptTM RT试剂盒（Takara公司）去除基因组DNA，将RNA反转录成cDNA。反转录体系为10μl，含有PrimeScriptTM缓冲液，PrimeScriptTM RT酶混合物，oligo dT引物(50μM)和随机引物两种(100μM)及500ng总RNA。Real-time反应:用得到的cDNA作为模板和特定引物进行PCR反应。使用SYBR(R) Premix Ex TaqTM试剂盒在ABI7500(ABI，USA)机器上进行定量PCR(Takara公司)。反应条件如下:95℃预变性30秒，40个PCR循环（95℃5秒和60℃30秒）。采用2-△△CT法量化各蛋白饮食组之间的相对基因表达。
5、流式细胞术
脾脏流式细胞术:
无菌取出感染前（第0d）和感染后第3d、5d小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0.17 mol/LNH4Cl裂解红细胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml。每份样品用抗-CD11 c-FITC单克隆抗体、抗-CD11b-PE单克隆抗体、抗-CD45R/B220-PerCP和抗-MHCⅡ-APC单克隆抗体进行四色分析，另设阴性对照管。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，每份样品用抗-CD11 c-FITC单克隆抗体和/或抗TLR4-PE单克隆抗体进行双色分析，另设阴性对照管，离心去上清后，每管加入固定透膜剂250μl，1h后，洗涤细胞，加入生物素-TLR-9抗体，4℃染色30 min，然后洗涤细胞，再加入亲和素-PE，4℃染色30 min，洗涤细胞之后每管加入0.3ml细胞染色缓冲液。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，刺激5h后，再加入抗-CD4-FITC单克隆抗体，固定透膜后加入抗T-bet-PerCP和IFN-γ-PE单克隆抗体，染色30min。离心去上清后，用0.3ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞。每管加入脾细胞悬液0.1m，然后除对照管外，每管加入CM-H2DCFDA（终浓度为5μM），37℃孵育30min，取出之后，用PBS洗涤，然后加入抗-F4/80-PerCP单克隆抗体和抗-CD11b-PE抗体进行染色，之后洗涤细胞加入0.3ml细胞染色缓冲液。每份样品用抗CD4-FITC和抗CD25-PE单抗进行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC单抗进行胞内染色，用含1％ FCS的PBS洗涤两次并悬浮于0.5 ml PBS中，流式细胞仪进行检测。
脑组织流式细胞术:
将小鼠处死，取出脑，用150目筛网研磨脑。然后加入到5ml含有100U/mlⅣ型胶原酶的RPMI1640中，42℃水浴45min。300g离心10min，收集细胞沉淀，用30％ Percoll重悬沉淀，然后加入到70％ Percoll上层（用PBS配制），515×g室温离心30 min。收集中间层，加入10 ml PBS300×g离心10 min，然后标记相应的抗体:FITC-CD4、PE-CD11b、PerCP-CD8和APC-Gr-1。4℃染色30 min，PBS洗涤细胞两次，上机检测，Flowjo软件分析。
6、ELISA
用ELISA试剂盒分别检测血清或脾细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α及IL-10的分泌水平。酶标仪测定450nm处OD值。实验操作按照试剂盒说明书进行，结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMax Pro4.3.1Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/ml)。
7、统计学分析
使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t检验和one wayANOVA比较分析组内和组间均值差异。采用Kaplan-Meyer方法进行生存期分析。P＜0.05为显著差异。
实验结果:
1、不同含量酪蛋白饮食对ECM小鼠的感染率和生存期的影响
感染Pb ANKA的NC组小鼠于d3，在外周血中可见疟原虫感染的红细胞(infectedred blood cells，iRBCs)，随后红细胞感染率缓慢上升并维持在较低水平(＜10％)，于d5-9全部死于CM。5％酪蛋白饮食组小鼠在d9之前的原虫血症水平变化与NC组小鼠相似，但小鼠全部存活，之后，原虫血症水平逐渐升高，在感染后d23达到峰值(～50％)，d24～25死于贫血。20％和35％酪蛋白饮食组在感染后d7才可镜检到iRBCs，两组红细胞感染率显著低于Pb ANKA感染小鼠(NC组)，随后红细胞感染率一直处于较低水平(＜2％)，于感染后d14红细胞感染率降至为0，小鼠自愈。
2、不同含量蛋白饮食对体重及ECM临床评分影响
感染前1个月给予蛋白饮食会增加小鼠体重。各组小鼠体重在感染Pb ANKA后d1-d3体重下降，随后NC组、20％和35％酪蛋白饮食组小鼠体重回升，而5％酪蛋白饮食组小鼠体重持续下降（与其它各组相比，P＜0.05）。感染Pb ANKA会引起给予维持饲料的C57BL/6小鼠(NC组)在d5-9天发生CM而死亡，与之相比，给予三种浓度的酪蛋白饮食会明显降低CM发生期间的临床评分（与NC组相比，P＜0.05），同时低蛋白饮食(5％酪蛋白组)组小鼠的皮毛微微竖起，提示低蛋白饮食会影响小鼠的生理功能。
3、不同含量酪蛋白饮食改善ECM血脑屏障的通透性
脑疟发生时脑组织血管的通透性明显升高（与正常鼠相比，P＜0.01）。与NC组相比，给予不同含量酪蛋白饮食后能明显抑制ECM引起的通透性升高(P＜0.01)。
4、不同含量酪蛋白饮食对ECM血清前炎症细胞因子的影响
感染后d3和d5，与ECM发生密切相关的IFN-γ水平在给予不同含量的酪蛋白饮食后均显著低于NC组(P＜0.05);同时，各酪蛋白饮食组TNF-α水平在感染后d5也呈现相似的下降趋势(P＜0.05)。
5、不同含量酪蛋白饮食对脑组织CD4+、CD8+T细胞和中性粒细胞的影响
在感染后d5，给予酪蛋白饮食能明显降低脑组织中CD4+、CD8+T细胞和中性粒细胞的数量，提示不同含量酪蛋白饮食能降低脑组织中与脑疟过度前炎症免疫应答密切相关CD4+、CD8+T细胞和中性粒细胞的数量来预防ECM的发生。
6、不同含量酪蛋白饮食对脑组织ECM发生相关因子表达水平的影响
我们通过Real-time RT-PCR方法检测了脑组织中与ECM发生密切相关因子的mRNA表达水平。结果显示不同含量酪蛋白饮食均能抑制Pb ANKA感染后d5的前炎症因子IFN-γ、TNF-α和MMP9 mRNA水平，粘附分子ICAM-1和趋化因子CXCL9、CXCL10的基因表达水平也得到显著抑制（与正常感染相比，P＜0.05），而酪蛋白饮食组小鼠脑组织的抑炎性细胞因子IL-10水平在感染后d3显著高于NC组(P＜0.05)，TGF-β mRNA水平并未受到明显影响。由此提示给予不同含量酪蛋白饮食能够抑制ECM模型脑组织中的前炎症细胞因子、趋化因子和粘附分子的表达水平。
7、不同含量酪蛋白饮食对ECM脑部微血管粘附分子VCAM-1的影响
给予酪蛋白饮食能明显降低脑组织微血管VCAM-1的表达水平，降低VCAM-1表达阳性血管的数量及mRNA表达水平，提示不同含量酪蛋白饮食能通过降低脑组织VCAM-1的表达水平来预防ECM的发生。
8、酪蛋白饮食对ECM模型中Th1细胞及其相关细胞因子的影响
在感染后d3，给予20％和35％酪蛋白饮食能明显增强Th1细胞数量及IFN-γ的分泌水平（与NC组相比，P＜0.05）;在感染后d5，Th1细胞数量及TNF-α的分泌水平显著降低(与NC组相比，P＜0.05)。
9、不同含量酪蛋白饮食对ECM模型DC亚群及其功能分子的影响
在感染后d3，给予不同含量酪蛋白饮食不影响CD11c+DCs、mDCs和pDCs数量（与NC组相比，P＞0.05），同时TLR4和MHCⅡ分子表达水平也没有受到明显影响，但给予20％酪蛋白显著增强CD11c+ TLR9+ DCs细胞数量。在感染后d5酪蛋白饮食组mDCs的数量显著低于NC组(P＜0.05)，pDC和表达MHCⅡ类分子的CD11c+DCs数量没有明显改变（与NC组相比，P＞0.05），但表达TLR4和TLR9的CD11c+DCs数量明显降低（与NC组相比，P＜0.05）。
10、酪蛋白饮食对ECM模型中巨噬细胞的影响
在感染后d3，酪蛋白饮食组的CD11b+F4/80+巨噬细胞数量高于NC组(P＜0.05)，同时，酪蛋白饮食组中脾细胞培养上清中的NO分泌水平也显著高于NC组(P＜0.05)，但同时CD11b+F4/80+巨噬细胞的ROS水平却低于NC组。在感染后d5，酪蛋白饮食组与NC组之间的CD11b+F4/80+巨噬细胞数量没有显著差别，但20％酪蛋白饮食组的ROS水平高于NC组(P＜0.05)。
11、酪蛋白饮食对ECM模型中Treg及IL-10的影响
在感染后d3，酪蛋白饮食不影响Treg数量，20％和35％酪蛋白饮食组脾细胞培养上清中的IL-10水平显著高于NC组(P＜0.05)。在感染后d5，酪蛋白饮食会降低脾脏中Treg的数量及IL-10的mRNA水平，但培养上清中IL-10水平没有明显变化。
结论:
1.不同含量(5～35％)的酪蛋白饮食有助于维持血脑屏障的完整，预防ECM的发生。
2.5％酪蛋白（低浓度酪蛋白）饮食虽能预防ECM发生，但会降低小鼠体重，影响小鼠生理功能，使其无法抵抗疟原虫感染引起的重症贫血。
3.不同含量的酪蛋白饮食会显著降低ECM小鼠血清和脑组织中IFN-γ和TNF-α等前炎症细胞因子表达水平，抑制脑组织过度的炎症应答，从而预防ECM的发生。
4.不同含量的酪蛋白饮食能明显降低ECM小鼠脑组织中的CD4+、CD8+T细胞和中性粒细胞的数量，进一步减少前炎症细胞因子的分泌，减轻血管炎症反应，预防ECM的发生。
5.不同含量的酪蛋白饮食能显著降低脑组织与ECM发生密切相关的粘附分子和趋化因子的表达水平，防止血脑屏障的破坏，从而预防ECM的发生。
6.酪蛋白饮食可提高宿主感染早期Th1免疫应答，活化巨噬细胞，通过NO分泌，将原虫负荷控制在一定的水平，进而防止由原虫负荷引起的脑部过度炎症应答介导的ECM的发生。