碱性成纤维细胞生长因子对Aβ诱导PC12细胞ERK1/2和PKCγ活性影响

• 作 者: 赵艳华
• 机 构: 中国医科大学
• 出 处: 中国医科大学
• 发表日期: 2008年4期
• 关键词: 成纤维细胞成长因子

阿尔茨海默病(AD病)是一种伴有脑特征性病理及生化变化的认知功能障碍的临床综合症。AD常发生在老年人群，目前已成为继心脏病，肿瘤和中风之后的第四位死亡原因。
成纤维细胞成长因子(FGF)是一种由多种多肽因子组成的一个家庭，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是其中的一员，其信号传导复杂，生物学作用具多效性。
bFGF受体属酪氨酸蛋白激酶受体家族中的一员，由细胞外区，跨膜区和细胞内区组成，信号传导途径包括：1、PKC途径2、Ras/Raf/MEK/ERK途径3、JAK/STAT途径4、PI3K途径。
基底前脑胆碱能神经元变性是AD的重要病理特征，其病变程度和AD学习记忆减退相一致。国外一些研究表明，AD患者脑中胆碱能激动剂诱导的PI信号系统严重损伤，包括受体G蛋白功能，IPS与其受体的结合及蛋白激酶C活性均明显降低；AD患者脑中存在ERK下调机制，可能参与神经元退行性变的自我刺激过程以及这些条件下的错误修复。
目前，尚无bFGF对AD信号传导途径影响的报道。这里，我们用Aβ25-35诱导PC12细胞建立AD细胞模型，探讨bFGF对AD模型细胞PKCγ和ERK1/2活性的影响，通过干预不同信号传导途径可望为AD治疗提供新的思路与途径。
实验方法：
1、PC12细胞培养及传代
用含10％马血清、5％胎牛血清、100U/ml青霉素以及100μg/l链霉素的RPMI-1640培养基培养PC12细胞，放置于37℃，5％CO2培养箱中，两天换液一次，当PC12细胞覆盖瓶面密度达80％以上，吸出培养液，0.25％胰蛋白酶消化，吹打细胞并将细胞悬液倒入2个新的培养瓶，5-6天传代一次。
2、实验分组：
将细胞分为4组。1、对照组：常规加入培养液。2、Aβ损伤组：加入培养液及老化的Aβ25-35。3、bFGF组：加入培养液、bFGF及老化的Aβ25-35。4、抑制剂组：加入培养液、PD98059、bFGF及老化的Aβ25-35。
3、MTT法检测细胞存活率
将PC12细胞接种于96孔细胞培养板，分组加药，设空白对照组，每组3复孔，培养24小时。加入MTT20μl培养4小时，加入DMS0150μl，30分钟后，用酶标仪在570nm处读取各组细胞的吸光值(OD值)。
4、WestenBlot印迹分析
取对数生长期细胞，以5×106个细胞/孔接种于6孔板，分组加药，每组设3复孔，在培养箱中培养24小时。用细胞刮刀刮取细胞，PBS冲洗，加入裂解液，采用WestenBlot印迹分析，Ecl系统显影，ImageJ显像分析系统对印迹区带进行定量分析，测定PKCγ和P-ERK1/2蛋白表达。
5、统计学方法
使用SPSS12.0软件进行统计分析，各组资料用One-wayANOVA方法比较，统计分析用t检验，认为P＜0.05结果有统计学意义。
实验结果：
1、MTT法检测细胞存活率：Aβ损伤组与对照组相比OD值及细胞存活率显著降低，而bFGF组与Aβ损伤组相比OD值及细胞存活率显著升高。
2、WestenBlot结果
(1)AB损伤组较对照组ERK1/2，PKCγ活力均显著下降。
(2)bFGF组较Aβ损伤组ERK1/2，PKCγ活力显著增强，并与bFGF浓度呈正相关。
(3)抑制剂组较bFGF组ERK1/2，PKCγ活力显著下降，并与PD98059浓度呈正相关。
结论：
1、bFGF对AD模型细胞损伤具一定保护作用。
2、bFGF能增强AD模型细胞ERK1/2和PKCγ活性。
3、PD98059能抑制bFGF增强AD模型细胞ERK1/2和PKCγ活性的作用。