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目的:
观察胃癌细胞来源的外泌体对小鼠髓系未成熟细胞和淋巴细胞增殖分化的调控作用，初步探讨肿瘤细胞外泌体诱导免疫抑制的机制。
方法:
1.GES-1细胞株和SGC-7901细胞株，经含10%胎牛血清培养液常规培养后更换不含血清的RPMI-1640基础培养液继续培养48-72h，收集细胞培养上清液。
2.细胞培养上清经超滤浓缩后，采用超速离心法，在不同离心力和离心时间条件下提取GES-1细胞及SGC-7901细胞来源的外泌体。经透射电镜观察外泌体形态、免疫印迹技术检测其标志蛋白分子、纳米粒径分析仪检测外泌体颗粒直径，并与试剂法提取的外泌体进行比较。
3.外泌体经荧光抗体标记后，将GES-1细胞来源的外泌体、SGC-7901细胞来源的外泌体及相同剂量PBS分别经尾静脉注射到小鼠体内。提取外周血细胞及骨髓细胞，荧光显微镜观察骨髓细胞是否发出红色荧光，流式细胞术分析外泌体对小鼠骨髓中髓系未成熟细胞(immaturemyeloidcells，IMCs)及外周血中髓系来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、T细胞、B细胞及NK细胞频次的影响。
4.分离健康人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)，与荧光标记的外泌体共培养，通过流式细胞术检测可与外泌体结合的细胞。将NK细胞体外扩增，与SGC-7901细胞来源的外泌体共培养后检测NK细胞杀伤功能。
结果：
1.使用超速离心法，在离心力110000g,离心时长80min条件下分离提取外泌体，有较好提取效果。分离的囊泡经透射电镜观察，形态呈杯口状结构；免疫印迹法检测到所提取囊泡富含CD63、TSG101等外泌体标志分子；纳米粒径检测显示所提取囊泡大部分直径介于30-150nm之间。与试剂盒提取的外泌体比较，超速离心法提取的外泌体形态典型，蛋白表达高。
2.荧光显微镜下观察到小鼠骨髓细胞发出红色荧光。流式细胞术分析显示：PBS处理组IMCs频次为60.3±2.5%，GES-1细胞来源的外泌体处理组IMCs频次为52.7±1.7%，SGC-7901细胞来源的外泌体处理组IMCs频次为79.0±4.3%，两两比较，组间差异有统计学意义(p＜0.05)。GES-1细胞来源的外泌体促进小鼠外周血中MDSCs减少，其中G-MDSCs频次为26.6±4.0%，SGC-7901细胞来源的外泌体促进小鼠外周血中MDSCs增多，其中G-MDSCs频次为65.4±6.5%，两组间比较，差异有统计学意义(p＜0.05)。
3.SGC-7901细胞来源的外泌体显著促进T细胞和B细胞增殖，其中T细胞频次为77.3±3.0%，B细胞频次为31.6±0.9%，而GES-1细胞来源的外泌体处理组T细胞频次为48.4±1.0%，B细胞频次为21.3±2.2%，两组间比较，差异有统计学意义(p＜0.05)；PBS处理组中T细胞频次为49.8±1.4%，B细胞频次为21.6±2.5%，与另外两组比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。
4.人PBMC与外泌体共培养后，SGC-7901细胞来源的外泌体可与NK细胞和B细胞结合。NK细胞与SGC-7901细胞来源的外泌体共培养后对靶细胞的杀伤能力与正常对照组比有明显减弱，组间差异有统计学意义(p＜0.05)。
结论：
1.改良超速离心法能提高外泌体的纯度与产量，为胃癌细胞外泌体功能研究奠定基础。
2.胃癌细胞外泌体可在骨髓内聚集，可能影响髓系未成熟细胞的分化与成熟。
3.胃癌细胞外泌体促进T细胞、B细胞扩增，诱导NK细胞免疫杀伤能力发生缺陷。
观察胃癌细胞来源的外泌体对小鼠髓系未成熟细胞和淋巴细胞增殖分化的调控作用，初步探讨肿瘤细胞外泌体诱导免疫抑制的机制。
方法:
1.GES-1细胞株和SGC-7901细胞株，经含10%胎牛血清培养液常规培养后更换不含血清的RPMI-1640基础培养液继续培养48-72h，收集细胞培养上清液。
2.细胞培养上清经超滤浓缩后，采用超速离心法，在不同离心力和离心时间条件下提取GES-1细胞及SGC-7901细胞来源的外泌体。经透射电镜观察外泌体形态、免疫印迹技术检测其标志蛋白分子、纳米粒径分析仪检测外泌体颗粒直径，并与试剂法提取的外泌体进行比较。
3.外泌体经荧光抗体标记后，将GES-1细胞来源的外泌体、SGC-7901细胞来源的外泌体及相同剂量PBS分别经尾静脉注射到小鼠体内。提取外周血细胞及骨髓细胞，荧光显微镜观察骨髓细胞是否发出红色荧光，流式细胞术分析外泌体对小鼠骨髓中髓系未成熟细胞(immaturemyeloidcells，IMCs)及外周血中髓系来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、T细胞、B细胞及NK细胞频次的影响。
4.分离健康人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)，与荧光标记的外泌体共培养，通过流式细胞术检测可与外泌体结合的细胞。将NK细胞体外扩增，与SGC-7901细胞来源的外泌体共培养后检测NK细胞杀伤功能。
结果：
1.使用超速离心法，在离心力110000g,离心时长80min条件下分离提取外泌体，有较好提取效果。分离的囊泡经透射电镜观察，形态呈杯口状结构；免疫印迹法检测到所提取囊泡富含CD63、TSG101等外泌体标志分子；纳米粒径检测显示所提取囊泡大部分直径介于30-150nm之间。与试剂盒提取的外泌体比较，超速离心法提取的外泌体形态典型，蛋白表达高。
2.荧光显微镜下观察到小鼠骨髓细胞发出红色荧光。流式细胞术分析显示：PBS处理组IMCs频次为60.3±2.5%，GES-1细胞来源的外泌体处理组IMCs频次为52.7±1.7%，SGC-7901细胞来源的外泌体处理组IMCs频次为79.0±4.3%，两两比较，组间差异有统计学意义(p＜0.05)。GES-1细胞来源的外泌体促进小鼠外周血中MDSCs减少，其中G-MDSCs频次为26.6±4.0%，SGC-7901细胞来源的外泌体促进小鼠外周血中MDSCs增多，其中G-MDSCs频次为65.4±6.5%，两组间比较，差异有统计学意义(p＜0.05)。
3.SGC-7901细胞来源的外泌体显著促进T细胞和B细胞增殖，其中T细胞频次为77.3±3.0%，B细胞频次为31.6±0.9%，而GES-1细胞来源的外泌体处理组T细胞频次为48.4±1.0%，B细胞频次为21.3±2.2%，两组间比较，差异有统计学意义(p＜0.05)；PBS处理组中T细胞频次为49.8±1.4%，B细胞频次为21.6±2.5%，与另外两组比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。
4.人PBMC与外泌体共培养后，SGC-7901细胞来源的外泌体可与NK细胞和B细胞结合。NK细胞与SGC-7901细胞来源的外泌体共培养后对靶细胞的杀伤能力与正常对照组比有明显减弱，组间差异有统计学意义(p＜0.05)。
结论：
1.改良超速离心法能提高外泌体的纯度与产量，为胃癌细胞外泌体功能研究奠定基础。
2.胃癌细胞外泌体可在骨髓内聚集，可能影响髓系未成熟细胞的分化与成熟。
3.胃癌细胞外泌体促进T细胞、B细胞扩增，诱导NK细胞免疫杀伤能力发生缺陷。