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中华绒螯蟹是我国重要的特种经济养殖水产品，近来年，不同的致病菌导致中华绒螯蟹感染各种疾病，对其养殖业造成一定的经济损失，因此探究中华绒螯蟹先天免疫作用机制对其疾病防控具有重要意义。细胞黏附蛋白(Peroxinectin)是一种具有粘附特性和过氧化物酶活性的蛋白，在中华绒螯蟹先天性免疫机制中起到重要作用，但关于其发挥免疫作用的分子机制尚不清楚。本研究通过细菌结合和体内细菌清除试验对Peroxinectin重组蛋白免疫功能进行探究，并进一步采用GST-Pulldown和siRNA干扰技术研究Peroxinectin发挥免疫作用的分子机制。获得以下结果：
1、扩增了Peroxinectin的功能结构域，通过测序和BLAST分析发现，所获得的目的片段序列与中华绒螯蟹Peroxinectin序列相似性为100％，与日本大眼蟹Peroxinectin相似性为87.26％，与克原氏鳌虾Peroxinectin相似性为65.04％，与三疣梭子蟹Peroxinectin相似性为74.67％，与南美白对虾Peroxinectin相似性为66.92％。系统发育分析发现，扩增产物序列与中华绒螯蟹和其他虾蟹类(包括日本大眼蟹、三疣梭子蟹、克氏原鳌虾、南美白对虾等)Peroxinectin聚为一支，说明所扩增的产物即为中华绒螯蟹Peroxinectin的功能结构域。
2、构建了Peroxinectin-GST原核重组质粒，诱导表达并纯化了Peroxinectin-GST重组蛋白，进一步对Peroxinectin-GST重组蛋白免疫功能分析发现，Peroxinectin-GST重组蛋白能以不同亲和力结合枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌，结合能力从强到弱依次为枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌；Peroxinectin-GST重组蛋白还可以促进中华绒螯蟹对副溶血弧菌的清除，注射Peroxinectin-GST重组蛋白10min后，残留的副溶血弧菌的百分数与对照组相比下降了19.33％(P＜0.05)，注射15min后，与对照组相比，残留菌的百分数下降了28.67％(P＜0.05)。说明中华绒螯蟹细胞粘附蛋白Peroxinectin能有效结合和清除外源细菌感染。
3、获得了Integrin、CuZn-SOD的功能结构域，构建了Peroxinectin-HIS、Integrin-GST和CuZn-SO-HIS结构域的原核重组质粒，诱导表达并纯化了Peroxinectin-HIS、Integrin-GST和CuZn-SOD-HIS的重组蛋白。将Peroxinectin-HIS和Integrin-GST、Peroxinectin-GST和CuZn-SO-HIS、Integrin-GST和CuZn-SO-HIS分别进行GST-Pulldown，SDS-PAGE和Westernblot检测到Peroxinectin和Integrin体外能够直接发生相互作用，同时Peroxinectin和CuZn-SOD在体外也能够发生相互作用，Integrin和CuZn-SOD也有相互作用关系。说明Peroxinectin蛋白可能是通过与Integrin、CuZn-SOD相互作用而引起中华绒螯蟹对外源细菌感染的免疫反应。
4、开展了siRNA干扰Peroxinectin试验，结果表明：特定条件下，体内注射48h，Peroxinectin基因表达量下降47.26％(P＜0.05)，同时检测到Integrin基因表达量下降25.34％(P＜0.05)，CuZn-SOD基因的表达量下降了54.25％(P＜0.05)，Dorsal基因的表达量下降了63.45％(P＜0.01)，Lectin基因的表达量下降68.47％(P＜0.001)。但是在24hGST基因表达量出现显著性上升(P＜0.05)。在24h、48h、72h和96hPPAF基因和Relish基因的表达量均没有出现任何显著性的变化。进一步说明了这三个蛋白之间存在相互作用关系，且通过引起相关效应基因表达变化发挥抗菌功能。
综上所述，本研究表明中华绒螯蟹Peroxinectin重组蛋白可以识别结合不同细菌，同时能促进机体对副溶血弧菌的清除；进一步研究发现，Peroxinectin是通过与Integrin和CuZn-SOD互作，进而激活相关免疫效应基因表达来应对外源细菌感染，达到免疫保护机体的目的。
1、扩增了Peroxinectin的功能结构域，通过测序和BLAST分析发现，所获得的目的片段序列与中华绒螯蟹Peroxinectin序列相似性为100％，与日本大眼蟹Peroxinectin相似性为87.26％，与克原氏鳌虾Peroxinectin相似性为65.04％，与三疣梭子蟹Peroxinectin相似性为74.67％，与南美白对虾Peroxinectin相似性为66.92％。系统发育分析发现，扩增产物序列与中华绒螯蟹和其他虾蟹类(包括日本大眼蟹、三疣梭子蟹、克氏原鳌虾、南美白对虾等)Peroxinectin聚为一支，说明所扩增的产物即为中华绒螯蟹Peroxinectin的功能结构域。
2、构建了Peroxinectin-GST原核重组质粒，诱导表达并纯化了Peroxinectin-GST重组蛋白，进一步对Peroxinectin-GST重组蛋白免疫功能分析发现，Peroxinectin-GST重组蛋白能以不同亲和力结合枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌，结合能力从强到弱依次为枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌；Peroxinectin-GST重组蛋白还可以促进中华绒螯蟹对副溶血弧菌的清除，注射Peroxinectin-GST重组蛋白10min后，残留的副溶血弧菌的百分数与对照组相比下降了19.33％(P＜0.05)，注射15min后，与对照组相比，残留菌的百分数下降了28.67％(P＜0.05)。说明中华绒螯蟹细胞粘附蛋白Peroxinectin能有效结合和清除外源细菌感染。
3、获得了Integrin、CuZn-SOD的功能结构域，构建了Peroxinectin-HIS、Integrin-GST和CuZn-SO-HIS结构域的原核重组质粒，诱导表达并纯化了Peroxinectin-HIS、Integrin-GST和CuZn-SOD-HIS的重组蛋白。将Peroxinectin-HIS和Integrin-GST、Peroxinectin-GST和CuZn-SO-HIS、Integrin-GST和CuZn-SO-HIS分别进行GST-Pulldown，SDS-PAGE和Westernblot检测到Peroxinectin和Integrin体外能够直接发生相互作用，同时Peroxinectin和CuZn-SOD在体外也能够发生相互作用，Integrin和CuZn-SOD也有相互作用关系。说明Peroxinectin蛋白可能是通过与Integrin、CuZn-SOD相互作用而引起中华绒螯蟹对外源细菌感染的免疫反应。
4、开展了siRNA干扰Peroxinectin试验，结果表明：特定条件下，体内注射48h，Peroxinectin基因表达量下降47.26％(P＜0.05)，同时检测到Integrin基因表达量下降25.34％(P＜0.05)，CuZn-SOD基因的表达量下降了54.25％(P＜0.05)，Dorsal基因的表达量下降了63.45％(P＜0.01)，Lectin基因的表达量下降68.47％(P＜0.001)。但是在24hGST基因表达量出现显著性上升(P＜0.05)。在24h、48h、72h和96hPPAF基因和Relish基因的表达量均没有出现任何显著性的变化。进一步说明了这三个蛋白之间存在相互作用关系，且通过引起相关效应基因表达变化发挥抗菌功能。
综上所述，本研究表明中华绒螯蟹Peroxinectin重组蛋白可以识别结合不同细菌，同时能促进机体对副溶血弧菌的清除；进一步研究发现，Peroxinectin是通过与Integrin和CuZn-SOD互作，进而激活相关免疫效应基因表达来应对外源细菌感染，达到免疫保护机体的目的。