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作为一种具有生物催化活性的添加剂，蛋白酶在许多工业生产中都有着非常广泛的应用，其在动物营养中的应用也越来越受到广泛关注，大量的研究结果也已经表明，蛋白酶能够提高畜禽等陆生动物对蛋白质、多肽及氨基酸的消化能力。而在水生动物方面，蛋白酶的研究与应用还处于起步阶段，因此，为了探寻蛋白酶在水产饲料中的精准应用方案，本研究以吉富罗非鱼(genetically improved farmed tilapia, GIFT, Oreochromis niloticus)为研究对象，比较了不同来源、不同水平蛋白酶在吉富罗非鱼饲料中的应用效果，研究了蛋白酶对蛋白质的节约效应和蛋白酶对饲料原料在体外酶解后的应用效果，揭示了蛋白酶对GIFT的生长、健康及肌肉品质的影响。具体研究结果如下：
1.低蛋白饲料中分别添加四种蛋白酶对吉富罗非鱼生长、饲料利用与健康的影响
为了比较4种蛋白酶对GIFT生长性能、饲料利用与健康等的影响，对4种蛋白酶的酶学性质进行了研究，并配制了高蛋白饲料(HP)、低蛋白饲料(LP)、低蛋白+Hupro蛋白酶饲料(LPH)、低蛋白+酸性蛋白酶饲料(LPAC)、低蛋白+中性蛋白酶饲料(LPN)和低蛋白+碱性蛋白酶饲料(LPAK)饲喂GIFT56d。结果发现：不同蛋白酶的酶学性质存在较大的差别。养殖试验结果表明，LPH组试验鱼的FBW、WGR、SGR、PER、干物质和部分必需氨基酸的表观消化率均高于其它各组(P＜0.05)，而FCR和FC显著低于其它各组(P＜0.05)；各组试验鱼的CF、HSI以及鱼体水分、粗蛋白含量、粗灰分无显著差异(P＞0.05)。LPH组试验鱼血清中TP的含量显著高于其它各组，而AST显著低于其它蛋白酶添加组(P＜0.05)。LPH组和LPN组试验鱼肝细胞的细胞核面积显著大于其它组，LPH组、LPAC组和LPN组试验鱼肝脏的抗氧化能力高于其它各组(P＜0.05)。4种蛋白酶的添加均提高了试验鱼肝、中肠、后肠蛋白酶的活性。LPH组、LPAC组和LPN组试验鱼肠道中鲸杆菌属的丰度显著低于其它各组，而肠道微生物的多样性显著高于其它各组(P＜0.05)。综合上述各项指标的评估结果来看，以Hupro蛋白酶在GIFT低蛋白饲料中的应用效果最好。
2.无鱼粉饲料中添加不同浓度蛋白酶对吉富罗非鱼生长与健康的影响
为了考察在无鱼粉饲料中蛋白酶的最适添加量，配制了蛋白酶添加水平分别为0、1.38、2.76、5.52和11.02U/g的5组无鱼粉饲料(PE0、PE1、PE2、PE3、PE4)和一组与无鱼粉饲料等能等氮的鱼粉饲料(FM)饲喂GIFT。养殖试验结束后，采用无乳链球菌进行攻毒试验。结果显示，随着饲料中蛋白酶添加量的增加，试验鱼的FBW、WGR和SGR呈先增加后降低的趋势(P＜0.05)。饲料添加不同浓度蛋白酶显著降低了试验鱼的CF和VSI、增加了鱼体的水分(P＜0.05)。PE3组罗非鱼肌肉中粗脂肪和苦味氨基酸含量显著低于鱼粉组和无鱼粉对照组(P＜0.05)。胃及肠道中食糜中蛋白酶的活性均随着外源蛋白酶添加水平的上升而显著增加(P＜0.05)，且PE4组试验鱼胃、前肠、中肠和后肠中食糜蛋白酶的活性均达到最高值。添加蛋白酶组饲料中干物质、粗蛋白和粗脂肪的表观消化率均显著高于其它各组(P＜0.05)，其中以PE2和PE3组的值较高。PE3组试验鱼的肠道在发育状况、形态结构及抗氧化能力等指标方面均优于其它处理组(P＜0.05)。PE3组试验鱼肝细胞中空泡面积以及肝脏中TGK的含量和AST的活性均显著低于其它各组，而肝脏的抗氧化能力显著高于其它各组(P＜0.05)。PE1、PE2、PE3和PE4组试验鱼血清AKP的活性和GLU的含量均显著高于其它各组(P＜0.05)，PE3组试验鱼血清中各项抗氧化指标和免疫指标最佳。PE3组试验鱼肝脏GHRmRNA的表达量以及胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶mRNA的表达水平均高于其他各组(P＜0.05)。攻毒试验结果也表明，PE3组试验鱼对无乳链球菌感染的抵抗力最强。基于本试验的研究结果，以WGR为评价指标，根据折线回归得出，GIFT无鱼粉饲料中蛋白酶的添加水平为5.68U/g。
3.蛋白酶对吉富罗非鱼饲料中蛋白质的节约效应
本实验研究了在不同饲料蛋白质水平饲料中添加不同浓度蛋白酶对GIFT生长性能、饲料利用、血清生化指标和肝肠结构的影响。试验配制了2种蛋白水平[29%(MP)和27%(LP)]和6个蛋白酶添加水平(分别为MP0、MP125、MP250、MP375、MP500、MP625和LP0、LP125、LP250、LP375、LP500、LP625)]的饲料，另设31%蛋白水平不添加蛋白酶的饲料作为对照(HP)，分别投喂试验鱼。结果表明：MP500组试验鱼的FBW、WGR、SGR与HP组无显著差异(P＞0.05)，而较MP0组有了显著提高(P＜0.05)，FCR较HP组和MP0组显著降低(P＜0.05)。在LP0组中添加125-625mg/kg蛋白酶，试验鱼的FBW、WGR、SGR均显著高于MP0组和LP0组，而显著低于HP组(P＜0.05)。蛋白酶的添加对试验鱼的HSI、VSI和CF未造成显著影响(P＞0.05)。与HP组和MP0组，MP375组FCR显著降低，PER显著提高(P＜0.05)，而LP625组FCR显著提高，FC显著降低(P＜0.05)。LP375组、LP500组和LP625组FNO较其它各组显著降低(P＜0.05)。在MP和LP组中，随着蛋白酶添加量的增加，试验鱼血清中AST和ALT的活性以及GLU含量均显著降低，而BUN的含量则显著增加(P＜0.05)。在MP625组和LP500组试验鱼肝细胞空泡面积显著降低(P＜0.05)。MP500组和LP500组试验鱼的前肠、中肠和后肠绒毛高度以及后肠的绒毛宽度和肌层厚度显著高于其它各组(P＜0.05)。以上结果表明，在31%饲料蛋白水平的基础上，降低2%的蛋白水平，添加500mg/kg蛋白酶的蛋白酶，不会影响GIFT的生长性能，而降低4%的蛋白水平添加蛋白酶，则会降低试验鱼的生长性能。
4.三种酶解动物蛋白原料替代鱼粉对吉富罗非鱼生长、健康和肌肉品质的影响
本试验研究了3种不同的酶解动物蛋白原料分别替代鱼粉对GIFT生长、肌肉品质、饲料利用与健康的影响，以探寻酶解对动物蛋白原料品质的改善作用。配制6组饲料：鱼粉组(FM)、酶解鱼粉组(E-FM)、鸡肝粉组(CLM)、酶解鸡肝粉组(E-CLM)、肠膜蛋白粉组(DPS)、酶解肠膜蛋白粉组(E-DPS)，饲喂GIFT幼鱼。结果表明：与FM组相比，CLM组、DPS组的生长和饲料效率未出现显著差异；但E-FM组、E-CLM组和E-DPS组鱼的FBW、WGR、SGR、PER、PRE和干物质表观消化率显著低于FM组，而FCR显著高于FM组(P＜0.05)。3种酶解原料替代鱼粉均降低了试验鱼全鱼中粗脂肪的含量和肌肉的拉丝性，而提高试验鱼肌肉的硬度和回弹力(P＜0.05)。3种酶解原料对鱼粉的替代均提高试验鱼血清和肝脏抗氧化能力，降低了试验鱼肝细胞空泡面积，促进了肠绒毛的发育(P＜0.05)。3种酶解原料对鱼粉的替代，对试验鱼肠道微生物的多样性及功能未造成显著影响(P＞0.05)。酶解鱼粉替代鱼粉增加了ASCT2、ATB0,+、b0,+AT基因的表达，降低了PepT1基因的表达(P＜0.05)；酶解鸡肝粉和酶解肠膜蛋白粉替代鱼粉均降低了ASCT2、ATB0,+、b0,+AT基因的表达，降低了PepT1基因的表达(P＜0.05)。综上所述，在本试验条件下，采用酶解鱼粉、酶解鸡肝粉和酶解肠膜蛋白粉全部替代饲料中的鱼粉会影响GIFT的生长性能和饲料利用效率，但是改善了试验鱼的肉质和健康状况。
1.低蛋白饲料中分别添加四种蛋白酶对吉富罗非鱼生长、饲料利用与健康的影响
为了比较4种蛋白酶对GIFT生长性能、饲料利用与健康等的影响，对4种蛋白酶的酶学性质进行了研究，并配制了高蛋白饲料(HP)、低蛋白饲料(LP)、低蛋白+Hupro蛋白酶饲料(LPH)、低蛋白+酸性蛋白酶饲料(LPAC)、低蛋白+中性蛋白酶饲料(LPN)和低蛋白+碱性蛋白酶饲料(LPAK)饲喂GIFT56d。结果发现：不同蛋白酶的酶学性质存在较大的差别。养殖试验结果表明，LPH组试验鱼的FBW、WGR、SGR、PER、干物质和部分必需氨基酸的表观消化率均高于其它各组(P＜0.05)，而FCR和FC显著低于其它各组(P＜0.05)；各组试验鱼的CF、HSI以及鱼体水分、粗蛋白含量、粗灰分无显著差异(P＞0.05)。LPH组试验鱼血清中TP的含量显著高于其它各组，而AST显著低于其它蛋白酶添加组(P＜0.05)。LPH组和LPN组试验鱼肝细胞的细胞核面积显著大于其它组，LPH组、LPAC组和LPN组试验鱼肝脏的抗氧化能力高于其它各组(P＜0.05)。4种蛋白酶的添加均提高了试验鱼肝、中肠、后肠蛋白酶的活性。LPH组、LPAC组和LPN组试验鱼肠道中鲸杆菌属的丰度显著低于其它各组，而肠道微生物的多样性显著高于其它各组(P＜0.05)。综合上述各项指标的评估结果来看，以Hupro蛋白酶在GIFT低蛋白饲料中的应用效果最好。
2.无鱼粉饲料中添加不同浓度蛋白酶对吉富罗非鱼生长与健康的影响
为了考察在无鱼粉饲料中蛋白酶的最适添加量，配制了蛋白酶添加水平分别为0、1.38、2.76、5.52和11.02U/g的5组无鱼粉饲料(PE0、PE1、PE2、PE3、PE4)和一组与无鱼粉饲料等能等氮的鱼粉饲料(FM)饲喂GIFT。养殖试验结束后，采用无乳链球菌进行攻毒试验。结果显示，随着饲料中蛋白酶添加量的增加，试验鱼的FBW、WGR和SGR呈先增加后降低的趋势(P＜0.05)。饲料添加不同浓度蛋白酶显著降低了试验鱼的CF和VSI、增加了鱼体的水分(P＜0.05)。PE3组罗非鱼肌肉中粗脂肪和苦味氨基酸含量显著低于鱼粉组和无鱼粉对照组(P＜0.05)。胃及肠道中食糜中蛋白酶的活性均随着外源蛋白酶添加水平的上升而显著增加(P＜0.05)，且PE4组试验鱼胃、前肠、中肠和后肠中食糜蛋白酶的活性均达到最高值。添加蛋白酶组饲料中干物质、粗蛋白和粗脂肪的表观消化率均显著高于其它各组(P＜0.05)，其中以PE2和PE3组的值较高。PE3组试验鱼的肠道在发育状况、形态结构及抗氧化能力等指标方面均优于其它处理组(P＜0.05)。PE3组试验鱼肝细胞中空泡面积以及肝脏中TGK的含量和AST的活性均显著低于其它各组，而肝脏的抗氧化能力显著高于其它各组(P＜0.05)。PE1、PE2、PE3和PE4组试验鱼血清AKP的活性和GLU的含量均显著高于其它各组(P＜0.05)，PE3组试验鱼血清中各项抗氧化指标和免疫指标最佳。PE3组试验鱼肝脏GHRmRNA的表达量以及胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶mRNA的表达水平均高于其他各组(P＜0.05)。攻毒试验结果也表明，PE3组试验鱼对无乳链球菌感染的抵抗力最强。基于本试验的研究结果，以WGR为评价指标，根据折线回归得出，GIFT无鱼粉饲料中蛋白酶的添加水平为5.68U/g。
3.蛋白酶对吉富罗非鱼饲料中蛋白质的节约效应
本实验研究了在不同饲料蛋白质水平饲料中添加不同浓度蛋白酶对GIFT生长性能、饲料利用、血清生化指标和肝肠结构的影响。试验配制了2种蛋白水平[29%(MP)和27%(LP)]和6个蛋白酶添加水平(分别为MP0、MP125、MP250、MP375、MP500、MP625和LP0、LP125、LP250、LP375、LP500、LP625)]的饲料，另设31%蛋白水平不添加蛋白酶的饲料作为对照(HP)，分别投喂试验鱼。结果表明：MP500组试验鱼的FBW、WGR、SGR与HP组无显著差异(P＞0.05)，而较MP0组有了显著提高(P＜0.05)，FCR较HP组和MP0组显著降低(P＜0.05)。在LP0组中添加125-625mg/kg蛋白酶，试验鱼的FBW、WGR、SGR均显著高于MP0组和LP0组，而显著低于HP组(P＜0.05)。蛋白酶的添加对试验鱼的HSI、VSI和CF未造成显著影响(P＞0.05)。与HP组和MP0组，MP375组FCR显著降低，PER显著提高(P＜0.05)，而LP625组FCR显著提高，FC显著降低(P＜0.05)。LP375组、LP500组和LP625组FNO较其它各组显著降低(P＜0.05)。在MP和LP组中，随着蛋白酶添加量的增加，试验鱼血清中AST和ALT的活性以及GLU含量均显著降低，而BUN的含量则显著增加(P＜0.05)。在MP625组和LP500组试验鱼肝细胞空泡面积显著降低(P＜0.05)。MP500组和LP500组试验鱼的前肠、中肠和后肠绒毛高度以及后肠的绒毛宽度和肌层厚度显著高于其它各组(P＜0.05)。以上结果表明，在31%饲料蛋白水平的基础上，降低2%的蛋白水平，添加500mg/kg蛋白酶的蛋白酶，不会影响GIFT的生长性能，而降低4%的蛋白水平添加蛋白酶，则会降低试验鱼的生长性能。
4.三种酶解动物蛋白原料替代鱼粉对吉富罗非鱼生长、健康和肌肉品质的影响
本试验研究了3种不同的酶解动物蛋白原料分别替代鱼粉对GIFT生长、肌肉品质、饲料利用与健康的影响，以探寻酶解对动物蛋白原料品质的改善作用。配制6组饲料：鱼粉组(FM)、酶解鱼粉组(E-FM)、鸡肝粉组(CLM)、酶解鸡肝粉组(E-CLM)、肠膜蛋白粉组(DPS)、酶解肠膜蛋白粉组(E-DPS)，饲喂GIFT幼鱼。结果表明：与FM组相比，CLM组、DPS组的生长和饲料效率未出现显著差异；但E-FM组、E-CLM组和E-DPS组鱼的FBW、WGR、SGR、PER、PRE和干物质表观消化率显著低于FM组，而FCR显著高于FM组(P＜0.05)。3种酶解原料替代鱼粉均降低了试验鱼全鱼中粗脂肪的含量和肌肉的拉丝性，而提高试验鱼肌肉的硬度和回弹力(P＜0.05)。3种酶解原料对鱼粉的替代均提高试验鱼血清和肝脏抗氧化能力，降低了试验鱼肝细胞空泡面积，促进了肠绒毛的发育(P＜0.05)。3种酶解原料对鱼粉的替代，对试验鱼肠道微生物的多样性及功能未造成显著影响(P＞0.05)。酶解鱼粉替代鱼粉增加了ASCT2、ATB0,+、b0,+AT基因的表达，降低了PepT1基因的表达(P＜0.05)；酶解鸡肝粉和酶解肠膜蛋白粉替代鱼粉均降低了ASCT2、ATB0,+、b0,+AT基因的表达，降低了PepT1基因的表达(P＜0.05)。综上所述，在本试验条件下，采用酶解鱼粉、酶解鸡肝粉和酶解肠膜蛋白粉全部替代饲料中的鱼粉会影响GIFT的生长性能和饲料利用效率，但是改善了试验鱼的肉质和健康状况。