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类胰岛素生长因子(IGFs)系统对生物体生长、发育、成熟、代谢以及细胞的增殖、分化、存活与迁移等一系列生命活动重要作用。近年来，本实验室在硬骨鱼类克隆了类胰岛素样生长因子家族的一个新成员--IGF-3(Insulin-likegrowth factor3)，它仅在性腺特异表达。对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的研究表明IGF-3可能在其性腺分化、发育、成熟和生殖周期中有重要作用。为进一步弄清IGF-3在性腺中的作用以及其可能的受体，本研究对尼罗罗非鱼IGF-3重组蛋白和三个IGFs受体进行了研究。
生物信息学分析表明，IGF-3与IGF-1和IGF-2一样包含有5个(A、B、C、D和E)结构域及信号肽(Signal peptide，SP)，众所周知，IGF-1和IGF-2的成熟肽都是去除了信号肽和E结构域后所形成的多肽，但IGF-3发挥功能的成熟肽是否与IGF-1和IGF-2一样不含E结构域和SP还未见报道。通过对信号肽和E结构域的取舍构建了IGF-3的四种表达型：FⅠ(完整多肽，分子量为20.4 KD)、FⅡ(去除SP，分子量为16.3 KD)、FⅢ(去E结构域，分子量为12.0 KD)FⅣ(去除SP和E结构域，分子量为7.9 KD)。将这四种表达型分别构建到PcoldⅠ和pGex-4T-1两种载体中，并成功表达了FⅡ-PcoldⅠ(His-IGF-3融合蛋白大小21.0 KD，N-端带有His-Tag标签，FⅡ型)和FⅣ-pGex-4T-1(GST-IGF-3融合蛋白大小33.9 KD，N-端带有GST-Tag标签，FⅣ型)两种类型的融合蛋白。用镍柱纯化获得较高纯度的His-IGF-3融合蛋白。经免疫三只Bal b/c雌性小鼠，每次免疫时间间隔15天，共免疫三次，每次抗原用量为25-30 ug，制备了IGF-3多克隆抗体；经ELISA方法检测，抗体效价达到1:10000。用His-Tag标签抗体(稀释倍数1:1000)、GST标签抗体(稀释倍数1:1000)和IGF-3多克隆抗体(稀释倍数为1:800)对IGF-3 FⅡ、FⅣ型融合蛋白和尼罗罗非鱼雌雄性腺抽提蛋白进行Western blot检测，证实抗体工作良好，且在雌雄性腺均检测到大小约为13KD的条带，表明IGF-3成熟肽很可能是含有B、C、A、D和部分的E结构域。免疫组化研究发现IGF-3蛋白表达于卵巢的颗粒细胞，精巢的间质细胞和支持细胞。用IGF-3纯化蛋白和抗体对罗非鱼卵巢碎片进行孵育研究发现所获得的IGF-3蛋白是有生物活性的，同时进一步证实抗体工作良好。
同时在本研究中，基于RT-PCR和RACE的方法，克隆了尼罗罗非鱼的三个IGFs受体，IGF-1Rα、两个IGF-1Rb的选择性剪切(IGF-1R6-IS1和部分IGF-1R-IS2)和IGF-2R。序列分析表明只有IGF-1Rα和IGF-1Rb具有对IGF信号通路至关重要的酪氨酸激酶结构域，IGF-2R却不具备这一结构域。系统进化树和蛋白结构分析表明IGF-1R和胰岛素受体(IR)拥有一个共同祖先，而IGF-2R则在IGF-1R之前由其他的基因进化而来。采用RT-PCR检测IGF-1Rα、IGF-1Rb和IGF-2R在孵化后240天(240 dah)的尼罗罗非鱼不同组织中的表达模式。IGF-1Rα在心脏中的表达量最高，IGF-1Rb在垂体、精巢和肾脏中表达量最高，而IGF-2R表达量最高的组织为肾脏。IGF-1Rα和IGF-1R6在卵巢和精巢中均有表达，且IGF-1Rα和IGF-1Rb在精巢中的表达量高于卵巢的，而IGF-2R在此时的精巢和卵巢中却无表达。Real-time PCR检测10至240 dah的罗非鱼雌、雄性腺中IGF-1Rα，TGF-1R，IGF-3和IGF-2R的表达变化规律。IGF-1Rα在30 dah的时候在卵巢中的表达量达到最高，之后开始下降，从40 dah开始低于精巢中的表达水平；直到50 dah在精巢中的表达水平达到最高。与之对比，IGF-1Rb在50 dah的时候在卵巢中的表达量达到最高，之后开始下降，从60 dah开始低于精巢中的表达水平；直到120 dah在精巢中的表达水平达到最高。而IGF-2R则有着相对其他三个基因更低的表达水平，仅在早期(10至70 dah)有较低水平的表达，且在70 dah时在卵巢中的表达水平达到最高，其在240 dah的精巢和卵巢中均检测不到，这与组织分布结果一致。IGF-3有着和IGF-1Rα相类似的表达模式；在30 dah的时候在卵巢中的表达量达到最高，之后开始下降，从40 dah开始低于精巢中的表达水平；直到150 dah在精巢中的表达水平达到最高。原位杂交结果表明IGF-1Rα和IGF-1Rb均表达于卵巢和精巢的间质细胞，同时还表达于精母细胞中。而IGF-2R无论在精巢还是卵巢都没有检测到信号。所有的数据分析表明IGFs的受体很可能是IGF-1Rs，而不是IGF-2R，且IGF-3的受体更倾向于是IGF-1Ra。