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红霉素(Erythromycin)是由红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)合成的一类14元大环内酯类抗生素。在其发酵液中,红霉素A(Er-A)为主要产物,此外还有少量副产物红霉素B,C和D(Er-B,C和D)的积累。红霉素A的抑菌活性最高,在临床上被广泛应用,目前市场上主要以其作为原料药进行新一代红霉素的合成。红霉素D是其生物合成途径中第一个具有生物活性的中间产物,红霉素B和C的活性较差,且具有一定的毒副作用,但红霉素B比A更具有耐酸性,红霉素C可被转化为巨大霉素及其相关衍生物,它们也可能作为先导化合物被用于开发活性更好的衍生物,具有一定的应用价值。为了提高红霉素工业生产菌株中红霉素A的含量,并得到能以红霉素B、C和D为主要产物的工业生产菌,本课题以红霉素工业生产菌株为对象,针对催化红霉素D转化为A的羟基化酶(erythromycin C-12 hydroxylase,EryK)和甲基化酶(ierythromycinO-methyltransferase,EryG),进行代谢工程改造。
首先,我们利用φC31整合酶介导的位点特异性整合,将羟基化酶和甲基化酶表达单元PermE-eryK-eryG-eryK整合到含φC31整合酶识别位点attB的S.erythraea-attB的染色体上,从而构建了重组菌S.erythraea-KGK。重组菌的发酵液中Er-A的比例可达91.1％,且Er-A产量提高了18.6％。这一结果表明,利用attB插入盒子实现的整合策略是可行的,为进一步在此基础上优化红霉素组分和产量奠定了基础。
其次,为了在单一菌株中分别实现红霉素B,C和D的大量积累,我们分别采用同源单交换和同源双交换,通过在工业菌HL3168E3染色体的eryG位点插入失活和对eryK基因缺失失活,得到高产Er-C的重组菌S.erythraeaQL-G和高产Er-B的重组菌S.erythraeaQL-K,使Er-C和Er-B的浓度分别达到2.55mg/ml和1.88mg/ml。在重组菌QL-K的基础上,对eryG基因进行插入失活,从而得到以Er-D为主要产物的重组菌S.erythraea QL-KG,其Er-D的浓度可达2.05mg/ml。这三个重组菌中各红霉素的产量与出发菌中红霉素A的产量相比没有明显变化,表明对后修饰途径的羟基化酶和甲基化酶进行遗传操作并不会影响红霉素的合成。此外,通过对各重组菌发酵过程中不同红霉素组分的分析,我们还发现在红霉素D向B和C转化的分支途径中,EryG催化合成红霉素B的效率,要高于EryK催化合成红霉素C。这三个突变株的成功构建,不仅使Er-B,C和D的大量获得变得更为简单易行,也对我们解析红霉素合成及后修饰途径提供了重要的信息。