水稻OsWAK124基因的分子克隆与功能研究

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细胞壁关联激酶(WAK)是一类特殊的植物类受体激酶,与细胞壁中的果胶共价交联。在结构上,WAK分为胞外域、跨膜域和胞内Ser/Thr激酶结构域,胞外域中在靠近跨膜域的附近存在保守的表皮生长因子样重复序列(EGF),EGF结构域被认为与细胞信号转导有关。研究证实,在模式植物拟南芥中,AtWAKs参与了植物生长发育、信号转导以及生物和非生物逆境胁迫有关的生理反应。应用生物信息学手段已在水稻基因组中注释了大约125个OsWAK基因,其中OsWAK124定位于水稻第12号染色体上,生物信息学预测结果显示其表达模式具有组织特异性,主要在植物幼嫩的叶片、茎和愈伤组织等生命力旺盛的组织部位,而在其他成熟部位表达较低。其表达的蛋白主要定位于细胞壁上。MPSS结果显示接种稻瘟病菌和白叶枯病菌后基因表达显著上调。   从美国密歇根大学专业水稻数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)下载OsWAK124基因全长序列(LOC Os12916540.1)及其启动子序列。以起始密码子ATG前2.7 kb的序列构建OsWAK124基因启动子与GUS基因融合的载体,采用农杆菌介导法侵染水稻胚性愈伤组织。获得的抗潮霉素转基因苗再用GUS引物对其鉴别,对获得的阳性苗分别在正常条件以及添加NaCI、SA、Cd2+等外源物质条件下培养,待植株长至3-5叶期时,分别取植株各部位进行GUS染色,结果发现在植株茎生长点部位有明显的着色,其他如叶、根部成熟区等部位未见明显的GUS染色,外源添加物NaCI、SA、Cd2+可以明显诱导GUS染色反应。   按照全长目的基因来设计引物,通过PCR克隆得到OsWAK124全长DNA序列,将这段序列装载到带有组成型启动子Ubi的表达载体pCAMBIA1301上,构建超表达载体。另外以位于OsWAK124的ORF内从+808位至+1221位的片段构建RNAi干涉载体。以超表达和RNAi两条途径分别使OsWAK124基因表达上调或下降,通过观察转基因水稻的生长发育以及在遭受逆境胁迫时的表型差异来推测该基因的功能。本试验采用了NaCI、SA和几种重金属离子处理3-5叶期的转基因幼苗,处理结果如下:在各种非生物逆境胁迫处理以及用SA模拟植物病害胁迫处理的条件下,超表达转基因苗的长势明显优于野生型(WT),而干涉植株出现较严重的胁迫表型。本实验同时跟踪观察了自然生长状态下转基因苗的生长发育情况,结果发现:随着水稻的生长发育表型差异逐渐开始明显,超表达转基因植株生长状态优于WT和干涉植株,抽穗结实期提前;干涉植株生长状态较差,部分植株甚至出现死亡情况。   实验结果表明:OsWAK124主要在植物生命力旺盛的组织部位表达,比如:茎生长点。该基因表达上调有助于提高水稻在遭受逆境胁迫时的耐受能力,而其下调则使植株抵抗逆境胁迫的能力下降。
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