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糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)患者临床常见而难治的微血管并发症之一，是导致终末期肾病(ESRD)和DM患者死亡的主要原因。约40％的1型DM和5～20％的2型DM患者可以发生DN。随着人们生活习惯、饮食结构的改变，DM的发病率在全球迅速上升，DN的发病率也在不断上升。因此，如何有效地预防、治疗DN已成为医学界共同关注的问题。
DM可由多种途径损害肾脏，并累及肾脏的所有结构，导致肾小球细胞增殖、肥大，基底膜增厚和进行性细胞外基质(ECM)堆积，最终导致弥漫性或结节性肾小球硬化。转化生长因子-β1(TGF-β1)是一种多功能的细胞因子，在DN发病中起着非常重要的作用。包括：促使肾脏固有细胞发生增殖、肥大，增加系膜细胞(MC)合成和分泌ECM，并通过增加基质降解酶抑制物活性而减少ECM的降解等方面作用。Smad蛋白是是TGF-β1与其细胞表面丝/苏氨酸激酶受体结合后，将其信号从细胞膜传递到细胞核过程中极其重要的细胞内信号介导分子。在哺乳动物细胞中，其家族可分为3大类：一是受体激活型Smad(R-Smads)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和可能的Smad8和Smad9；二是共同通路型Smad(Co-Smad)即Smad4；三是抑制型Smad(I-Smad)，包括Smad6和Smad7。其中参与TGF-β1信号传导的Smad蛋白主要包括Smad2、Smad3、Samd4和Smad7。TGF-β1/Smad信号通路在介导ECM代谢异常，促进DN发病中起着重要的作用。
西医在治疗DN上主要是控制高血糖、减少蛋白尿、控制高血压等对症治疗，但迄今为止尚没有一个能完全阻断DN进展的药物。因此，发挥中医药治疗DN的优势和特色，积极探求中医药治疗DN的有效方法，防止或延缓其发展具有重要的意义。
DN属于中医的“肾消”、“水肿”、“肾劳”、“关格”等范畴。脾肾虚是DN的发病基础，痰湿、浊毒、瘀血等是其发展过程中的促进因素，本虚标实是DN的病机特点。DN早期(Ⅰ～Ⅲ期)多表现阴虚或气阴两虚；DN临床期(Ⅳ期)多表现脾肾亏虚、水湿内停或夹瘀血阻络；DN终末期(Ⅴ期)多表现脾肾阴阳衰败、浊毒中阻。因此，对Ⅲ～Ⅳ期DN的治疗上以益气健脾、滋肾养阴兼活血通络为法。中药复方制剂肾康丸由黄芪、芡实、金樱子、水蛭、益母草等药物组成，功能益气健脾、补肾固涩，利尿消肿，活血通络，暗合Ⅲ～Ⅳ期DN的病因病机，具有标本兼治之功。肾康丸作为医院制剂，在临床治疗DN患者多年，疗效确切。临床观察和动物实验研究都表明，该药在一定程度上可改善DN一般症状，保护肾脏，延缓DN的进展。但其治疗DN的细胞分子水平的作用机制还不清楚，有待进一步研究。因此，本课题通过动物和细胞实验，从TGF-β1/Smad信号通路出发，探讨了肾康丸治疗DN的细胞分子基因水平的作用机制，为其临床应用提供实验依据。具体如下：
第1章肾康丸对DN大鼠肾保护作用的实验研究
目的：观察肾康丸对DN大鼠模型的治疗及肾脏保护作用，为进一步研究药物作用机制提供实验依据。
方法：首先用链脲佐菌素(STZ)按65mg·kg-1大鼠体重一次性腹腔内注射法建立大鼠DM模型，连续2周，测血糖、尿糖、尿量，若血糖值高于16.7mmol·L-1、尿糖(+++)以上、尿量增加1倍以上，则造模成功，计算成模率。模型成功后随机分为3组：模型对照组、开搏通组、肾康丸组，另设正常对照组(n=8只)。灌胃给药治疗8周，治疗期间及治疗后观察大鼠一般状况、血糖、尿糖。末次给药后将大鼠放入代谢笼中，计24h尿量和饮水量。然后用10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主动脉穿刺采血，分离血清，检测大鼠血糖、糖化血红蛋白(GHb)、24h尿蛋白总量(Upro)、24h尿白蛋白量(Ualb)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿肌酐(Ucr)、内生肌酐清除率(Ccr)；取大鼠肾脏，观察肾脏大小，计算肾重、相对肾重，并通过HE、Masson染色法和电镜观察大鼠肾脏组织病理变化。
结果：32只大鼠用于造模，成模率84.40％(27/32)，成模后病死率7.4％(2/27)。在治疗期间的8周里，模型组大鼠血糖均维持在16.7mmol·L-1以上，尿糖+++以上；表现出多饮、多食、多尿、消瘦的DM症状；与正常大鼠比较，GHb、SCr、BUN、Ccr、24hUpro、24hUalb等指标均升高，具有统计学意义(P＜0.01)；肾脏重量及相对肾重增加，具有显著性意义(P＜0.01)，且出现了相当于Mogensen分期的3期左右DN病理损害。与模型组大鼠比较，肾康丸和开搏通都可以改善大鼠基本状况，降低上述指标水平(开搏通组除外血糖指标)，具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)，减轻肾脏组织病理损害。
结论：肾康丸具有治疗DN大鼠，保护大鼠肾脏的作用。
第2章肾康丸对DN大鼠肾脏TGF-β1/Smad信号传导通路的影响
目的：探讨肾康丸对DN大鼠TGF-β1/Smad信号通路的的影响。
方法：取第1章各对照及治疗组大鼠肾脏，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法观察各组大鼠肾脏组织纤连蛋白(FN)和TGF-β1mRNA基因表达情况；采用免疫组化法观察各组大鼠肾脏组织FN、TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7蛋白表达的情况。
结果：DN模型组大鼠与正常大鼠比较，肾脏组织中FN和TGF-β1mRNA基因表达显著上调(P＜0.01)，FN、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达明显增加，而Smad7蛋白表达明显降低。与模型组大鼠比较，肾康丸和开搏通都可以抑制DN大鼠肾脏组织中FN和TGF-β1mRNA基因表达，具有统计学意义(P＜0.01)，减少FN、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白的表达，增加Smad7蛋白的表达。
结论：肾康丸可以抑制DN大鼠肾脏中TGF-β1/Smad信号传导通路的激活，减少ECM的合成和分泌，从而延缓DN进程。
第3章肾康丸对高糖培养的MC增殖和细胞周期的影响
目的：探讨肾康丸对体外高糖培养的系膜细胞(MC)及细胞周期的影响，为下一步分子作用机制的研究提供实验依据。
方法：16只大鼠随机分为4组，正常大鼠血清组、开搏通组、肾康丸大小剂量组。大鼠灌服相应的药物7天后，分离药物血清。体外培养大鼠MC，分别用正常浓度葡萄糖和不同高浓度葡萄糖(20，30和40mmol·L-1)刺激24、48、72和96小时后，MTT法测细胞增殖。另将高糖(30mmol·L-1)培养的MC分为5组：高糖对照组、正常大鼠血清对照组、开搏通组及肾康丸高低剂量组。另设正常葡萄糖组。培养72小时后，采用MTT法测定各组细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期。
结果：与正常葡萄糖组比较，20mmol·L-1葡萄糖在实验的96h里能促进MC增殖，但仅在72h和96h具有统计学意义(P＜0.05)。30mmol·L-1葡萄糖在实验的24h至96h里均能促进MC增殖，具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，72h内随着作用时间的延长，促进增殖作用越明显，72h后作用减弱，但仍有统计学意义。40mmol·L-1浓度的葡萄糖在48h内对MC增殖有促进作用，具统计学意义(P＜0.05)，48h后作用减弱，甚至转为抑制。
结论：高糖可以诱导MC增殖和细胞周期紊乱；肾康丸可以抑制高糖诱导的MC增殖，调整细胞周期。
第4章肾康丸对高糖培养MC细胞外基质和TGF-β1/Smad信号通路的影响
目的：探讨肾康丸对高糖培养MC细胞外基质和TGF-β1/Smad信号通路的影响。
方法：将体外高糖(30mmol·L-1)培养的MC分为5组：高糖对照组、正常大鼠血清对照组、开搏通组及肾康丸高低剂量组。另设正常葡萄糖组。培养72h后，酶联免疫吸附试验法(ELISA)法检测各组MC培养上清FN和TGF-β1含量；采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法观察各组MC细胞中FN和TGF-β1mRNA基因表达情况；采用Westernblot法检测各组MC细胞中Smad2、Smad3和Smad7蛋白表达的情况。
结果：与正常葡萄糖组比较，高糖培养组MC细胞上清中FN和TGF-β1含量增加，MC细胞中FN和TGF-β1mRNA基因表达上调，具有统计学意义(P＜0.01)，Smad2和Smad3蛋白表达增加，而Smad7蛋白表达降低。肾康丸和开搏通治疗后可以降低高糖诱导的FN和TGF-β1分泌量和mRNA基因表达的增加，具有统计学意义(P＜0.01)；减少Smad2和Smad3蛋白的表达，增加Smad7蛋白的表达。
结论：高糖可以激活MC中TGF-β1/Smad信号传导通路，诱导MC合成和分泌ECM增加；肾康丸可以抑制高糖激活MC细胞中TGF-β1/Smad信号传导通路，减少ECM的合成和分泌。
全文结论：本研究通过整体动物实验和体外细胞实验，再次证明肾康丸具有治疗DN和保护肾脏的作用；其作用机理与药物抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活，减少MC中ECM的分泌与基因合成有关，为其临床治疗DN提供了细胞分子基因水平的作用机制和实验依据。