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干旱是影响植物生长发育的重要环境因素之一。植物在进化过程中形成了系统、完善的耐受干旱胁迫的防御机制。通常情况下,植物会通过特异表达一些基因来应答干旱胁迫,一方面这些基因的表达不仅可以保护细胞结构;另一方面还可以调节信号传导过程及相关基因的表达。比如通过代谢蛋白酶产生的渗透保护剂不仅使植物细胞的渗透吸水能力得到提高,还可以对植物体内的抗氧化防御系统进行调节以提高细胞解毒、抗氧化防御能力。抗氧化系统在植物应答干旱胁迫时起着很重要的作用,其中SOD是近年来研究较多的抗氧化酶,而好好芭体内的SOD相关研究至今还未报道。
本实验室前期采用抑制消减杂交技术(SSH)和RACE技术克隆了资源植物好好芭干旱响应基因ScCu/ZnSOD和ScMnSOD。为研究这两类SOD在植物应答干旱胁迫中的功能及其表达调控机理,我们进行了以下研究。
(1)分别构建了ScCu/ZnSOD、ScMnSOD与GFP融合的植物双元表达载体,蘸花法转化野生型拟南芥。检测了转基因拟南芥体内ScCu/ZnSOD、ScMnSOD的定位情况,结果显示,ScCu/ZnSOD定位于细胞质中,ScMnSOD定位于线粒体内。根据定位结果克隆了拟南芥中同源的Cu/ZnSOD1、MnSOD基因,然后用原核表达系统表达、纯化了ScCu/ZnSOD、ScMnSOD、AtCu/ZnSOD1及AtMnSOD蛋白,并在体外检测了ScCu/ZnSOD和ScMnSOD蛋白还原超氧阴离子的能力,验证了好好芭两类SOD与拟南芥中同源的SOD具有相同的功能,且酶活差异很小,提示响应逆境胁迫的SOD具有特殊的表达特点。因此,对基因启动子进行了分析研究;
(2)采用GenomeWalking技术克隆了ScCu/ZnSOD、ScMnSOD基因启动子。生物信息学分析提示,两个基因启动子区域均含有与逆境胁迫相关顺式作用元件,其中ScCu/ZnSOD基因启动子具有与干旱相关的MBS元件及与防御胁迫相关的TC-richrepeats元件,ScMnSOD基因启动子含有ABRE、LTR等响应逆境胁迫的元件,并且两启动子均含有大量光响应元件。启动子分析结果显示,两基因在植物发育的各个时期的根、叶子均有表达,而在下胚轴部位不表达,两者的表达均可受到干旱、盐及ABA的诱导。提示ScCu/ZnSOD、ScMnSOD在植物应答非生物胁迫过程中发挥作用,为进一步证实二者在植物耐受逆境中的作用,我们进行了转基因实验研究;
(3)分别筛选拟南芥Cu/ZnSOD1、MnSOD基因T-DNA插入纯合突变体。比较分析T-DNA插入纯合突变体、野生型及过表达ScSODs拟南芥植株在不同时间、不同强度干旱和盐胁迫处理下的生理、生化指标差异,结果提示,过表达ScCu/ZnSOD和ScMnSOD均能提高植物耐受干旱、盐胁迫的能力。
本研究证明植物可通过调节Cu/ZnSOD、MnSOD基因的表达来应答干旱、盐逆境胁迫;两个基因的启动子特征分析为研究好好芭耐受干旱、盐等逆境胁迫的机理奠定了基础。同时本研究也为进一步研究好好芭其他抗逆基因的功能及调控机制做出了一些新的尝试。