【摘 要】
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由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是一种烈性传染病,对全球养猪行业造成了不可估量的损失。因其巨大的基因组结构和复杂多变的免疫逃逸机制,目前仍无有效的商品化疫苗。在病毒侵袭宿主机体的过程中,Ⅰ型干扰素是宿主防御病毒感染的重要组成部分,但是病毒往往能够进化出不同的策略来拮抗宿主的抗病毒作用,从而
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由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是一种烈性传染病,对全球养猪行业造成了不可估量的损失。因其巨大的基因组结构和复杂多变的免疫逃逸机制,目前仍无有效的商品化疫苗。在病毒侵袭宿主机体的过程中,Ⅰ型干扰素是宿主防御病毒感染的重要组成部分,但是病毒往往能够进化出不同的策略来拮抗宿主的抗病毒作用,从而达到在宿主体内繁殖并感染机体致死的目的。研究表明,ASFV拥有利用自身编码蛋白来拮抗宿主Ⅰ型干扰素产生以及信号转导的能力。F334L是ASFV编码的一种非结构蛋白,但是其在宿主抗病毒天然免疫中的作用尚不清楚。鉴于此,本研究以ASFV F334L蛋白为研究对象,旨在探究其抑制Ⅰ型干扰素介导的JAK-STAT信号转导途径中的分子机制,具体开展的研究如下:为了探究ASFV F334L是否对Ⅰ型干扰素信号转导途径有抑制作用,将构建的ASFV F334L真核表达质粒以不同浓度转染至HEK-293T细胞中。经双荧光素酶报告系统和实时荧光定量PCR技术检测分析ISRE启动子活性及ISGs的转录水平,结果显示ASFV F334L能够呈剂量依赖性的抑制ISRE启动子活性,同时能够下调多个ISGs（ISG15、ISG54、ISG56和OAS1）分子的转录。说明ASFV F334L对Ⅰ型干扰素信号转导途径有抑制作用。为了进一步确定F334L拮抗Ⅰ型干扰素信号转导途径的具体靶蛋白,我们首先通过实时荧光定量PCR检测F334L对JAK-STAT信号通路接头分子m RNA水平的影响,结果发现ASFV F334L对该通路关键节点分子的转录水平无影响。随之通过Western blot实验检测过表达F334L对接头分子的蛋白水平是否有影响,分析显示,ASFV F334L能够呈剂量依赖性地抑制IRF9的表达。基于此得出结论,ASFV F334L是通过下调IRF9的蛋白水平而非转录水平来抑制Ⅰ型干扰素信号转导的。为进一步探究ASFV F334L对该信号通路的抑制作用,通过间接免疫荧光和CoIP等方法对IRF9与F334L之间的相互作用进行了研究。结果显示过表达的ASFV F334L蛋白位于宿主细胞的细胞质中,F334L与IRF9之间存在特异性相互作用,且IRF9的核转移过程部分受到了阻碍。由于IRF9是JAK-STAT信号通路中ISGF3的重要组成部分,为探究ASFV F334L是否也会抑制另外两个重要成分p-STAT1、pSTAT2的入核,我们同样的通过间接免疫荧光实验观察。结果表明在F334L过表达后,p-STAT1与p-STAT2的核转移现象确实部分受到了阻碍。因此得出结论,ASFV F334L与IRF9之间存在特异性相互作用,同时能在一定程度上抑制ISGF3入核。随后为深入探究ASFV F334L降解IRF9的具体分子机制,在HEK-293T细胞中过表达F334L与IRF9,分别再用泛素-蛋白酶体抑制剂（MG132）、自噬途径抑制剂（Chloroquine）和广谱凋亡途径抑制剂（Z-VAD-FMK）进行处理。通过Western blot实验,发现ASFV F334L诱导IRF9蛋白的降解是通过泛素-蛋白酶体途径实现的。为进一步探究ASFV F334L诱导的IRF9的降解涉及的多聚泛素链修饰形式,我们将F334L、IRF9、His-K48-Ub或His-K63-Ub质粒共同转染至HEK-293T细胞中,利用Co-IP实验发现ASFV F334L介导IRF9的降解依赖K48多聚泛素链修饰。综上研究,我们发现ASFV F334L能够拮抗Ⅰ型干扰素信号转导途径,通过介导IRF9发生K48连接的泛素化修饰,进一步使其经过泛素-蛋白酶体途径降解,从而阻碍ISGF3的部分入核,最终抑制ISRE启动子活性及ISGs分子的表达。本研究阐述了ASFV逃逸宿主抗病毒天然免疫的新机制,为ASFV致病机制与宿主天然免疫系统之间的认识提供了新的理论基础。
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