【摘 要】
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梨褪绿叶斑伴随病毒（Pear chlorotic leaf spot-associated virus,PCLSaV）是本研究室新鉴定的侵染梨的欧洲山梣环斑病毒属（Emaravirus）病毒,该病毒基因组由5条负义单链RNA组成。为进一步明确PCLSaV分子特性和建立高效稳定的RT-PCR检测技术,本研究测定了两个PCLSaV分离物完整基因组序列,提纯和观察了该病毒的病毒粒子,设计了不同反转录及P
【基金项目】
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国家重点研发项目2017YED0110900和2019YFD1001800； 国家梨产业技术体系CARS-28岗位；
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梨褪绿叶斑伴随病毒（Pear chlorotic leaf spot-associated virus,PCLSaV）是本研究室新鉴定的侵染梨的欧洲山梣环斑病毒属（Emaravirus）病毒,该病毒基因组由5条负义单链RNA组成。为进一步明确PCLSaV分子特性和建立高效稳定的RT-PCR检测技术,本研究测定了两个PCLSaV分离物完整基因组序列,提纯和观察了该病毒的病毒粒子,设计了不同反转录及PCR检测引物用于PCLSaV的检测,分析了该病毒编码的特异蛋白P5的生物学功能。主要研究结果如下:1.对分别从湖北省和江苏省采集的2份梨样品（HB和NJ）进行了RNA测序,经序列组装和序列比对分析,均鉴定到PCLSaV基因组RNA1-5的部分片段序列,采用RT-PCR对NJ分离物基因组缺失部分进行了扩增,获得了2个分离物的完整基因组序列。序列分析的结果显示,不同分离物的基因组同一RNA链长度上存在一定的差异,但RNA链所编码的蛋白大小完全相同,不同分离物的RNA2和RNA5的核苷酸序列存在较大变异,最低一致性分别为90.0%和93.5%。采用基于PCLSaV RNA1-5序列的特异性引物,对表现褪绿叶斑症状的梨样品中PCLSaV的5条基因组RNA链进行RT-PCR检测,确认这5条RNA链为PCLSaV基因组RNA。从发病的梨叶片提取了PCLSaV的病毒粒子,发现PCLSaV病毒粒子大小有较大变化,直径为23-172 nm,与Emaravirus属其他病毒病毒粒子大小（80-120 nm）存在较大差异。2.分别使用随机引物（pd（N）6）和两条基于PCLSaV末端保守序列设计的引物（3C和5H）反转录合成c DNA,并利用基于RNA1、RNA3和RNA5设计特异性引物,采用RT-PCR和巢式RT-PCR检测PCLSaV,发现使用引物3C进行反转录和RNA5特异引物进行巢式RT-PCR检测具有较好的效果。分析了梨一年生枝条不同部位叶片和韧皮部组织中PCLSaV的RT-PCR检测效果,发现表现明显褪绿叶斑症状的梨叶片中PCLSaV的检出率较高,而韧皮部组织该病毒检出率很低。对从不同地区采集的178份梨叶片样品中PCLSaV进行了RT-PCR检测,结果显示表现褪绿斑点或环斑症状的110份梨样品中75份为PCLSaV阳性（68.2%）,而68份无症状表现的梨样品中仅有1份为PCLSaV阳性,该检测结果进一步表明PCLSaV侵染在可在梨树上诱导产生明显的病害症状。3.对PCLSaV编码蛋白的沉默抑制活性进行了分析,发现RNA5编码的病毒特异性蛋白P5具有弱抑制局部沉默和强抑制系统沉默的功能,还可引起本氏烟叶片细胞坏死和活性氧的积累,同时该蛋白可诱导病程相关蛋白基因表达水平的上升。亚细胞定位试验表明,P5定位于内质网、胞间连丝和细胞核,在细胞核中聚集形成不同大小的颗粒状结构,并能诱导内质网多泡体形成。双分子荧光互补试验结果显示,P5能自身互作,其互作场所与亚细胞定位一致。4.构建了核定位信号缺失、信号肽缺失及截短的6个P5突变体,发现缺失核定位信号和信号肽后P5均不能自身互作,但仍具有抑制GFP局部沉默并诱导本氏烟细胞坏死的能力,推测该核定位信号和信号肽不是P5抑制RNA沉默和诱导本氏烟细胞坏死所必需的。研究发现P5的氨基酸区域20-90 aa在该蛋白沉默抑制功能和诱导本氏烟细胞坏死中起重要作用。
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