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目的：建立一种TaqMan双重Real-time PCR方法，用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。 方法：以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因，合成2对引物和其相应的荧光探针，优化各个反应组分的浓度和实时荧光PCR循环程序，制作标准曲线，建立从模拟粪便中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重Real-time PCR方法。利用李斯特菌属中其它种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性；通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后，分别提取 DNA，采用 TaqMan双重Real-time PCR进行检测，以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。 结果：采用本研究建立的TaqMan双重Real-time PCR方法对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好，与其他种李斯特菌和其他病原茵均无交叉反应。模拟粪便中检测灵敏度分别为2.45×103CFU/g和2.92×103CFU/g；模拟粪便标本在3h内可得出检测结果，当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6CFU/g和伊氏李斯特菌含量为5CFU/g时，经过增菌后使用双重Real-time PCR方法可检测出阳性结果。 结论：本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因 hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重Real-time PCR检测方法，该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点，可用于临床、食品及环境标本的快速诊断，以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析。