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龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国华南地区具有较高经济价值的热带亚热带果树。龙眼果实质量和产量与其胚胎发育息息相关。植物体细胞胚胎与合子胚在发育过程基本相似，可作为研究植物胚胎发生机制的优良替代体系。植物体胚发生过程不仅受特异基因的调控，还受表观遗传调控，尤其是DNA甲基化，一定水平的DNA甲基化对植物体胚的正常发育是必须的。miRNA能够介导DNA的甲基化，该过程与miRNA加工合成途径中的相关蛋白有关，AGO作为miRNA加工合成途径中的关键蛋白，参与介导DNA的甲基化，因此，AGO基因可能参与调控植物的体胚发生过程，但是具体作用机制尚不清楚，目前，关于龙眼AGO表达调控和功能特异性研究仍有大量空白。因此，本研究首先从三代测序的龙眼基因组数据库中鉴定出AGO基因家族，对DlAGOs家族的表达模式进行了分析，利用异位表达的方法对龙眼AGO基因及启动子功能进行研究。最后，进行了龙眼胚性愈伤组织去甲基化的转录组学分析。以此来探究AGO在龙眼体胚发生早期的甲基化调控机制。主要研究结果如下：
1、龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1cDNA的克隆
从龙眼基因组数据库中共鉴定出AGO家族10个成员，并根据注释到拟南芥或水稻中的成员进行命名。这些DlAGOs基因分布于龙眼1、4、8、10、12、13、14和15号染色体，编码794-1064个氨基酸，含有AGO典型的保守结构域，且该家族的蛋白质均为亲水的碱性蛋白。系统进化树分析表明，不同物种的AGO可被分成4个分支,龙眼AGO与甜橙AGO亲缘关系最近。
RT-PCR结合RACE法从龙眼EC中克隆获得了DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1基因的cDNA全长序列，其长度分别为3425bp、3418bp、3775bp和3289bp。DlAGOs基因家族成员的氨基酸序列同源性较低，可能与其功能的多样性有直接的关系。
2、龙眼DlAGOs启动子的克隆与生物信息学分析
克隆获得了DlAGOs基因5’端侧翼序列长度分别为1437bp、1809bp、1514bp、1807bp、1707bp、1722bp、1784bp、1746bp、1794bp和1512bp。生物信息学分析表明，DlAGO1、DlAGO4和DlAGO5-2启动子含有CpG岛区域；DlAGOs启动子序列除了含有大量的核心元件TATA-box和CAAT-box外，还含有多种光响应、激素应答、环境胁迫响应等元件，说明龙眼AGO基因在激素响应、光响应及抗逆等方面可能具有调控作用。
3、龙眼DlAGOs家族的表达模式分析
DlAGOs不同成员在龙眼体胚发生早期阶段及合子胚发育阶段均有表达，尤其在胚胎发生的早中期具有较高的表达，不同成员具有一定功能的分工和互补，可能参与调控龙眼胚胎发生发育过程。DlAGOs在龙眼不同组织部位中的时空表达具有特异性，可能参与龙眼种子、花、幼果和茎的发育调控。
DlAGOs基因在激素处理、不同光质处理、高温和低温处理、盐胁迫、渗透胁迫、干旱胁迫以及ABA处理下均有响应，说明它们广泛参与了激素应答、光响应及非生物胁迫应答，但是不同成员具有不同的表达模式，这也体现了AGO基因家族成员之间功能的多样性。
4、龙眼DlAGOs启动子的功能验证
构建龙眼DlAGOs启动子表达载体瞬时转化烟草叶片和龙眼胚性愈伤组织EC，利用组织化学染色、GUS基因的瞬时表达及启动子激素应答分析。结果显示，DlAGOs启动子均具有驱动GUS基因表达的活性，其中proAGO5-1的驱动能力最强，ABA诱导DlAGOs启动子的转录活性，部分启动子受MeJA、SA和GA3的诱导，推测龙眼DlAGOs启动子为激素诱导型启动子。
5、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1的亚细胞定位研究
构建融合表达载体，瞬时转化洋葱内表皮细胞，以GFP为报告基因，利用激光共聚焦显微镜观察表达情况，亚细胞定位结果表明，龙眼DlAGO7主要定位于细胞核中，而DlAGO10和DlAGOMEL1主要定位于细胞质中。
6、5-氮胞苷对龙眼体胚发生早期及DlAGOs表达的影响
2,4-D和5-azac均会影响植物体胚的发生，本研究用2,4-D（0.1、0.5、1.0mg/L）与5-氮胞苷（5-azac：0、5、25、50、100uM）配合处理龙眼胚性愈伤组织。显微观察发现，5uM5-azac与0.1mg/L或0.5mg/L2,4-D配合使用，有利于球形胚产生；定量结果表明，DlAGOs响应2,4-D和5-azac的处理，其中DlAGO4在5uM5-azac处理下呈上调表达。
在MS培养基中添加0、2.5、5uM5-azac处理龙眼EC1、3、6、9和12d，显微观察发现，培养第9d，对照组未出现球形胚，而处理组中的龙眼胚性愈伤组织均发育至球形胚阶段；培养到第12d，对照组和处理组均出现了球形胚；定量结果表明，低浓度5-azac处理9d促进DlAGO4基因的表达。
7、5-氮胞苷处理下龙眼体胚发生早期的转录组学分析
用2.5uM5-azac处理龙眼EC9d，以不加5-azac为对照组，采用BGISEQ-500测序平台进行RNA高通量测序。测序结果表明，对照组与处理组相比总共有1,617个差异表达的基因，主要富集在植物病原互作、植物激素信号转导、植物MAPK信号通路、淀粉和糖代谢及丁酸盐代谢、C5-支化二元酸代谢、硫代谢、硒代化合物代谢等代谢通路。5-azac处理后，龙眼DNA甲基化水平降低，促进与龙眼体胚发生相关基因（FUS3、ABI3、FT1、GABA-T3、CAS、GLP等）和AGO4基因上调表达，从而促进龙眼早期体胚的发生。因此，5-azac处理促进龙眼DlAGO4基因的表达，DlAGO4与24-nt lmiRNA结合抑制DNA甲基化，促进龙眼体胚发生；5-azac抑制组蛋白乙酰化促进龙眼体胚发生；丁酸盐促进组蛋白丁酰化促进龙眼体胚发生，同时，丁酸盐代谢还参与植物抗逆。
1、龙眼体胚发生早期AGO家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1cDNA的克隆
从龙眼基因组数据库中共鉴定出AGO家族10个成员，并根据注释到拟南芥或水稻中的成员进行命名。这些DlAGOs基因分布于龙眼1、4、8、10、12、13、14和15号染色体，编码794-1064个氨基酸，含有AGO典型的保守结构域，且该家族的蛋白质均为亲水的碱性蛋白。系统进化树分析表明，不同物种的AGO可被分成4个分支,龙眼AGO与甜橙AGO亲缘关系最近。
RT-PCR结合RACE法从龙眼EC中克隆获得了DlAGO4、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1基因的cDNA全长序列，其长度分别为3425bp、3418bp、3775bp和3289bp。DlAGOs基因家族成员的氨基酸序列同源性较低，可能与其功能的多样性有直接的关系。
2、龙眼DlAGOs启动子的克隆与生物信息学分析
克隆获得了DlAGOs基因5’端侧翼序列长度分别为1437bp、1809bp、1514bp、1807bp、1707bp、1722bp、1784bp、1746bp、1794bp和1512bp。生物信息学分析表明，DlAGO1、DlAGO4和DlAGO5-2启动子含有CpG岛区域；DlAGOs启动子序列除了含有大量的核心元件TATA-box和CAAT-box外，还含有多种光响应、激素应答、环境胁迫响应等元件，说明龙眼AGO基因在激素响应、光响应及抗逆等方面可能具有调控作用。
3、龙眼DlAGOs家族的表达模式分析
DlAGOs不同成员在龙眼体胚发生早期阶段及合子胚发育阶段均有表达，尤其在胚胎发生的早中期具有较高的表达，不同成员具有一定功能的分工和互补，可能参与调控龙眼胚胎发生发育过程。DlAGOs在龙眼不同组织部位中的时空表达具有特异性，可能参与龙眼种子、花、幼果和茎的发育调控。
DlAGOs基因在激素处理、不同光质处理、高温和低温处理、盐胁迫、渗透胁迫、干旱胁迫以及ABA处理下均有响应，说明它们广泛参与了激素应答、光响应及非生物胁迫应答，但是不同成员具有不同的表达模式，这也体现了AGO基因家族成员之间功能的多样性。
4、龙眼DlAGOs启动子的功能验证
构建龙眼DlAGOs启动子表达载体瞬时转化烟草叶片和龙眼胚性愈伤组织EC，利用组织化学染色、GUS基因的瞬时表达及启动子激素应答分析。结果显示，DlAGOs启动子均具有驱动GUS基因表达的活性，其中proAGO5-1的驱动能力最强，ABA诱导DlAGOs启动子的转录活性，部分启动子受MeJA、SA和GA3的诱导，推测龙眼DlAGOs启动子为激素诱导型启动子。
5、DlAGO7、DlAGO10和DlAGOMEL1的亚细胞定位研究
构建融合表达载体，瞬时转化洋葱内表皮细胞，以GFP为报告基因，利用激光共聚焦显微镜观察表达情况，亚细胞定位结果表明，龙眼DlAGO7主要定位于细胞核中，而DlAGO10和DlAGOMEL1主要定位于细胞质中。
6、5-氮胞苷对龙眼体胚发生早期及DlAGOs表达的影响
2,4-D和5-azac均会影响植物体胚的发生，本研究用2,4-D（0.1、0.5、1.0mg/L）与5-氮胞苷（5-azac：0、5、25、50、100uM）配合处理龙眼胚性愈伤组织。显微观察发现，5uM5-azac与0.1mg/L或0.5mg/L2,4-D配合使用，有利于球形胚产生；定量结果表明，DlAGOs响应2,4-D和5-azac的处理，其中DlAGO4在5uM5-azac处理下呈上调表达。
在MS培养基中添加0、2.5、5uM5-azac处理龙眼EC1、3、6、9和12d，显微观察发现，培养第9d，对照组未出现球形胚，而处理组中的龙眼胚性愈伤组织均发育至球形胚阶段；培养到第12d，对照组和处理组均出现了球形胚；定量结果表明，低浓度5-azac处理9d促进DlAGO4基因的表达。
7、5-氮胞苷处理下龙眼体胚发生早期的转录组学分析
用2.5uM5-azac处理龙眼EC9d，以不加5-azac为对照组，采用BGISEQ-500测序平台进行RNA高通量测序。测序结果表明，对照组与处理组相比总共有1,617个差异表达的基因，主要富集在植物病原互作、植物激素信号转导、植物MAPK信号通路、淀粉和糖代谢及丁酸盐代谢、C5-支化二元酸代谢、硫代谢、硒代化合物代谢等代谢通路。5-azac处理后，龙眼DNA甲基化水平降低，促进与龙眼体胚发生相关基因（FUS3、ABI3、FT1、GABA-T3、CAS、GLP等）和AGO4基因上调表达，从而促进龙眼早期体胚的发生。因此，5-azac处理促进龙眼DlAGO4基因的表达，DlAGO4与24-nt lmiRNA结合抑制DNA甲基化，促进龙眼体胚发生；5-azac抑制组蛋白乙酰化促进龙眼体胚发生；丁酸盐促进组蛋白丁酰化促进龙眼体胚发生，同时，丁酸盐代谢还参与植物抗逆。