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本研究以福建省珍稀核果类果树地方品种——油柰为材料，采用染色体步移技术，分离出两个在外源SA处理下差异表达的WRKY基因（PsWRKY22和PsWRKY33）的5’端调控序列，通过启动子分析网站PlantCARE分析这两个基因启动子中的顺式作用元件；应用Gateway技术，构建含5’端序列不同长度缺失片段的植物融合GUS表达载体并转化拟南芥（Col-0），获得转基因植株，对这些转基因植株进行GUS活性分析，确定这两个基因启动子的组织特异性表达，研究结果如下：
1）启动子克隆与顺式作用元件分析：以油柰基因组DNA为模板，采用染色体步移技术，获得2个油柰WRKY转录因子（PsWRKY22和PsWRKY33）编码基因的5’端调控序列，长度分别为1774bp和1871bp；应用启动子在线软件PlantCARE分析这两个序列中的顺式作用元件，分析结果表明，PsWRKY22基因5’调控序列中含有ABRE、MYB、P-box、TCA-element、W-box等与逆境胁迫响应相关的元件；PsWRKY33基因5’调控序列中含有ABRE、MYB、LTR、TCA-element等可能应答不同逆境胁迫的顺式作用元件，初步预测这两个基因的表达可能受低温、干旱和外源激素等外界环境条件的诱导或者抑制。
2）含5’端缺失片段的植物表达载体构建与转化拟南芥：根据PsWRKY22基因5’端调控序列顺式作用元件的分布情况，对PsWRKY22基因启动子进行缺失应答SA元件（TCA-element）片段的构建，获得SA元件缺失表达载体，将其命名为pPsWRKY22-P1::GUS(-1498bp/-1(ATG))。对PsWRKY33基因5’端调控序列进行缺失ABRE，ERE，MYB等顺式作用元件，构建含不同长度5’端调控序列缺失片段的GUS融合植物表达载体，命名为pPsWRKY33-P1::GUS(-852bp/-1(ATG))、pPsWRKY33-P2::GUS(-357bp/-1(ATG))和pPsWRKY33-P3::GUS(-271bp/-1(ATG))。通过浸花法分别将各个表达载体转化到拟南芥（Col-0）中，经HYG筛选获得转基因阳性植株。
3）启动子活性分析：PsWRKY22启动子全长及其缺失体在外源激素（MeJA，SA，ETH和ABA）及非生物胁迫（低温、盐、干旱）处理下受到不同程度的抑制，缺失片段的GUS活性明显要低于全长。在外源SA处理下，PsWRKY22启动子活性（1）明显受抑制，其酶活分别下降为0.0679（pPsWRKY22）和0.0022（pPsWRKY22-P1）。PsWRKY33启动子全长片段及其缺失体在未处理植株上，随缺失的片段越长，其GUS表达活性越低（pPsWRKY33GUS活性为1，pPsWRKY33-P1GUS活性为0.4614，pPsWRKY33-P2GUS活性为0.2749，pPsWRKY33-P3GUS活性为0.2129）。PsWRKY33启动子及其缺失片段在低温处理下均可以诱导下游GUS基因的上调表达（如pPsWRKY33的GUS活性由1上升到1.3315），在ETH处理下pPsWRKY33-P3受诱导表达上调最明显（GUS活性为由0.2129上调为0.9177）。而在干旱、盐、ABA、MeJA、SA处理下，4个片段的GUS酶活基本是下调表达，尤其在SA处理下表达活性最低（pPsWRKY33GUS活性下调为0.1805，pPsWRKY33-P1GUS活性下调为0.0839，pPsWRKY33-P2GUS活性下调为0.0632，pPsWRKY33-P3GUS活性下调为0.0167）。
以上研究结果明确了PsWRKY22和PsWRKY33基因启动子在外源激素以及多种非生物胁迫下的活性特征，为进一步探究WRKY转录因子在非生物胁迫和外源激素作用下诱导油柰抗逆性基因表达的分子机制提供理论依据。
1）启动子克隆与顺式作用元件分析：以油柰基因组DNA为模板，采用染色体步移技术，获得2个油柰WRKY转录因子（PsWRKY22和PsWRKY33）编码基因的5’端调控序列，长度分别为1774bp和1871bp；应用启动子在线软件PlantCARE分析这两个序列中的顺式作用元件，分析结果表明，PsWRKY22基因5’调控序列中含有ABRE、MYB、P-box、TCA-element、W-box等与逆境胁迫响应相关的元件；PsWRKY33基因5’调控序列中含有ABRE、MYB、LTR、TCA-element等可能应答不同逆境胁迫的顺式作用元件，初步预测这两个基因的表达可能受低温、干旱和外源激素等外界环境条件的诱导或者抑制。
2）含5’端缺失片段的植物表达载体构建与转化拟南芥：根据PsWRKY22基因5’端调控序列顺式作用元件的分布情况，对PsWRKY22基因启动子进行缺失应答SA元件（TCA-element）片段的构建，获得SA元件缺失表达载体，将其命名为pPsWRKY22-P1::GUS(-1498bp/-1(ATG))。对PsWRKY33基因5’端调控序列进行缺失ABRE，ERE，MYB等顺式作用元件，构建含不同长度5’端调控序列缺失片段的GUS融合植物表达载体，命名为pPsWRKY33-P1::GUS(-852bp/-1(ATG))、pPsWRKY33-P2::GUS(-357bp/-1(ATG))和pPsWRKY33-P3::GUS(-271bp/-1(ATG))。通过浸花法分别将各个表达载体转化到拟南芥（Col-0）中，经HYG筛选获得转基因阳性植株。
3）启动子活性分析：PsWRKY22启动子全长及其缺失体在外源激素（MeJA，SA，ETH和ABA）及非生物胁迫（低温、盐、干旱）处理下受到不同程度的抑制，缺失片段的GUS活性明显要低于全长。在外源SA处理下，PsWRKY22启动子活性（1）明显受抑制，其酶活分别下降为0.0679（pPsWRKY22）和0.0022（pPsWRKY22-P1）。PsWRKY33启动子全长片段及其缺失体在未处理植株上，随缺失的片段越长，其GUS表达活性越低（pPsWRKY33GUS活性为1，pPsWRKY33-P1GUS活性为0.4614，pPsWRKY33-P2GUS活性为0.2749，pPsWRKY33-P3GUS活性为0.2129）。PsWRKY33启动子及其缺失片段在低温处理下均可以诱导下游GUS基因的上调表达（如pPsWRKY33的GUS活性由1上升到1.3315），在ETH处理下pPsWRKY33-P3受诱导表达上调最明显（GUS活性为由0.2129上调为0.9177）。而在干旱、盐、ABA、MeJA、SA处理下，4个片段的GUS酶活基本是下调表达，尤其在SA处理下表达活性最低（pPsWRKY33GUS活性下调为0.1805，pPsWRKY33-P1GUS活性下调为0.0839，pPsWRKY33-P2GUS活性下调为0.0632，pPsWRKY33-P3GUS活性下调为0.0167）。
以上研究结果明确了PsWRKY22和PsWRKY33基因启动子在外源激素以及多种非生物胁迫下的活性特征，为进一步探究WRKY转录因子在非生物胁迫和外源激素作用下诱导油柰抗逆性基因表达的分子机制提供理论依据。