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急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种由各种各样的非心源性致伤因素引起的破坏性肺部疾病。该病主要特征为肺水肿、低氧血症等。发病机制涉及瀑布样炎症、细胞凋亡、凝血纤溶系统的异常活化、氧化应激等。ALI的治疗策略包括通气疗法、药物干预法与间充质基质细胞疗法等方案。然而，这些治疗方式不仅未能有效降低ALI患者的死亡率，反而增加了气压伤、神经肌肉无力、免疫抑制等风险。因此，ALI防治药物的研发仍是一项首要任务。
二烯丙基二硫醚(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中油溶性提取物的有效活性成分之一，属于烯丙基硫化物。已有研究显示，DADS对慢性阻塞性肺病、哮喘有良好的改善效果，但其在ALI疾病方面的研究鲜有报道，且作用机制暂未完全阐明。此外，服用DADS结构类似物会刺激胃组织，并且DADS较差的溶解性与稳定性也阻碍了其进一步的研发与临床转化。因此，本课题拟将DADS制成环糊精包合物，以改善其溶解性和刺激性;然后，在体内外水平研究DADS包合物对LPS诱导的ALI的预防疗效及作用机制。
本论文的研究主要分为三部分:(1)二烯丙基二硫醚-羟丙基-β-环糊精(DADS-HP-β-CD)包合物的制备、表征与质量评价;(2)DADS-HP-β-CD包合物体外调节炎症作用及机制研究;(3)DADS-HP-β-CD包合物对小鼠急性肺损伤的保护作用及机制研究。
第一部分研究的内容主要涉及DADS含量测定方法的建立、包合材料的筛选、包合工艺的优化、DADS-HP-β-CD包合物的表征与质量评价。首先，使用高效液相色谱仪建立了DADS的含量测定方法，并以增溶因子为指标筛选出适宜的包合材料为HP-β-CD。然后，经单因素考察与正交实验设计确定了DADS-HP-β-CD包合物的最优制备工艺为:HP-β-CD与DADS的质量比为22，包合速度与时间分别为600r/min和3h。采用红外光谱(FT-IR)测试技术验证了包合物的形成。最后，通过溶解度、胃刺激性、稳定性等实验对DADS-HP-β-CD包合物进行了性能考察。实验结果显示:DADS-HP-β-CD包合物可使DADS在纯水中的溶解度提高1000多倍，减轻了原料药DADS在灌胃给药时引起的胃黏膜脱落。与物理混合物相比，DADS-HP-β-CD包合物显著提高了DADS的光、热稳定性。
第二部分在Raw264.7细胞模型中探究了DADS-HP-β-CD包合物的体外抗炎作用及分子机制。首先，我们通过细胞活力实验确定了DADS-HP-β-CD的安全浓度为12.5-100μM。其次，使用LPS建立体外炎症模型，通过测定NO的浓度与炎症因子(IL-6、IL-1β、TGF-β)的mRNA水平评价了DADS-HP-β-CD对炎症的调节作用。结果显示，DADS-HP-β-CD明显抑制了LPS导致的NO分泌量、IL-6与IL-1βmRNA表达量的增加，并有效促进了TGF-β在基因水平上的表达，从而发挥抗炎的作用。此外，DADS-HP-β-CD可以显著抑制mTOR/HIF-1α信号通路的活化。
第三部分研究主要在体内水平评价了DADS-HP-β-CD包合物对ALI的保护作用，并探索了其潜在的机制。小鼠先灌胃给药DADS-HP-β-CD或NAC一周;然后以气管递送LPS的方法建立ALI模型;诱导24h后，收集肺组织与肺泡灌洗液，以进行药效学及机制研究。研究结果显示，ALI模型小鼠的BALF中LDH活性与蛋白浓度呈明显性的升高，紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin)的基因表达量呈明显性的减少。而DADS-HP-β-CD对上述变化有较好的逆转作用，并可在一定程度上恢复受损的肺组织，说明其能够有效缓解ALI。另外，我们利用试剂盒、RT-PCR、WesternBlot测试技术对炎症与凋亡相关指标进行了检测。测定结果指出，DADS-HP-β-CD一方面能够抑制中性粒细胞向小鼠肺脏的迁移积累、降低IL-1β与IL-6等炎症因子的表达水平，另一方面能够升高IL-10、TGF-β等抗炎因子的表达水平，进而达到减轻炎症的作用。同时，DADS-HP-β-CD对LPS诱导的级联凋亡也显示出了显着抑制作用，表现为:降低caspase-3的活性、上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达。作用机制研究结果显示，DADS-HP-β-CD可能是通过抑制mTOR/HIF-1α与JNK信号通路的激活进而调节炎症与凋亡，最终发挥其抗ALI的药理作用。
综上所述，本课题首先基于DADS溶解性差、稳定性不高、对胃肠道有刺激性的现状制备了DADS-HP-β-CD包合物，评价结果显示，DADS-HP-β-CD包合物可显著改善DADS的溶解性、稳定性与胃刺激性。然后，本课题从细胞与动物层面研究了DADS-HP-β-CD包合物对急性肺损伤的保护作用及分子机制。研究结果显示，DADS-HP-β-CD包合物可能通过调控mTOR/HIF-1α和JNK信号通路的激活来抑制炎症与凋亡，从而实施其减轻ALI的疗效。
二烯丙基二硫醚(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中油溶性提取物的有效活性成分之一，属于烯丙基硫化物。已有研究显示，DADS对慢性阻塞性肺病、哮喘有良好的改善效果，但其在ALI疾病方面的研究鲜有报道，且作用机制暂未完全阐明。此外，服用DADS结构类似物会刺激胃组织，并且DADS较差的溶解性与稳定性也阻碍了其进一步的研发与临床转化。因此，本课题拟将DADS制成环糊精包合物，以改善其溶解性和刺激性;然后，在体内外水平研究DADS包合物对LPS诱导的ALI的预防疗效及作用机制。
本论文的研究主要分为三部分:(1)二烯丙基二硫醚-羟丙基-β-环糊精(DADS-HP-β-CD)包合物的制备、表征与质量评价;(2)DADS-HP-β-CD包合物体外调节炎症作用及机制研究;(3)DADS-HP-β-CD包合物对小鼠急性肺损伤的保护作用及机制研究。
第一部分研究的内容主要涉及DADS含量测定方法的建立、包合材料的筛选、包合工艺的优化、DADS-HP-β-CD包合物的表征与质量评价。首先，使用高效液相色谱仪建立了DADS的含量测定方法，并以增溶因子为指标筛选出适宜的包合材料为HP-β-CD。然后，经单因素考察与正交实验设计确定了DADS-HP-β-CD包合物的最优制备工艺为:HP-β-CD与DADS的质量比为22，包合速度与时间分别为600r/min和3h。采用红外光谱(FT-IR)测试技术验证了包合物的形成。最后，通过溶解度、胃刺激性、稳定性等实验对DADS-HP-β-CD包合物进行了性能考察。实验结果显示:DADS-HP-β-CD包合物可使DADS在纯水中的溶解度提高1000多倍，减轻了原料药DADS在灌胃给药时引起的胃黏膜脱落。与物理混合物相比，DADS-HP-β-CD包合物显著提高了DADS的光、热稳定性。
第二部分在Raw264.7细胞模型中探究了DADS-HP-β-CD包合物的体外抗炎作用及分子机制。首先，我们通过细胞活力实验确定了DADS-HP-β-CD的安全浓度为12.5-100μM。其次，使用LPS建立体外炎症模型，通过测定NO的浓度与炎症因子(IL-6、IL-1β、TGF-β)的mRNA水平评价了DADS-HP-β-CD对炎症的调节作用。结果显示，DADS-HP-β-CD明显抑制了LPS导致的NO分泌量、IL-6与IL-1βmRNA表达量的增加，并有效促进了TGF-β在基因水平上的表达，从而发挥抗炎的作用。此外，DADS-HP-β-CD可以显著抑制mTOR/HIF-1α信号通路的活化。
第三部分研究主要在体内水平评价了DADS-HP-β-CD包合物对ALI的保护作用，并探索了其潜在的机制。小鼠先灌胃给药DADS-HP-β-CD或NAC一周;然后以气管递送LPS的方法建立ALI模型;诱导24h后，收集肺组织与肺泡灌洗液，以进行药效学及机制研究。研究结果显示，ALI模型小鼠的BALF中LDH活性与蛋白浓度呈明显性的升高，紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin)的基因表达量呈明显性的减少。而DADS-HP-β-CD对上述变化有较好的逆转作用，并可在一定程度上恢复受损的肺组织，说明其能够有效缓解ALI。另外，我们利用试剂盒、RT-PCR、WesternBlot测试技术对炎症与凋亡相关指标进行了检测。测定结果指出，DADS-HP-β-CD一方面能够抑制中性粒细胞向小鼠肺脏的迁移积累、降低IL-1β与IL-6等炎症因子的表达水平，另一方面能够升高IL-10、TGF-β等抗炎因子的表达水平，进而达到减轻炎症的作用。同时，DADS-HP-β-CD对LPS诱导的级联凋亡也显示出了显着抑制作用，表现为:降低caspase-3的活性、上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达。作用机制研究结果显示，DADS-HP-β-CD可能是通过抑制mTOR/HIF-1α与JNK信号通路的激活进而调节炎症与凋亡，最终发挥其抗ALI的药理作用。
综上所述，本课题首先基于DADS溶解性差、稳定性不高、对胃肠道有刺激性的现状制备了DADS-HP-β-CD包合物，评价结果显示，DADS-HP-β-CD包合物可显著改善DADS的溶解性、稳定性与胃刺激性。然后，本课题从细胞与动物层面研究了DADS-HP-β-CD包合物对急性肺损伤的保护作用及分子机制。研究结果显示，DADS-HP-β-CD包合物可能通过调控mTOR/HIF-1α和JNK信号通路的激活来抑制炎症与凋亡，从而实施其减轻ALI的疗效。