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目的：
通过16S rDNA测序技术及非靶标代谢平台分析戊四氮致痫大鼠肠道菌群结构及其代谢谱的变化，探讨癫痫发作与肠道菌群的内在关系及不同干预方法对戊四氮致痫大鼠肠道菌群结构及其代谢谱的影响，分析癫痫的肠道菌群代谢组学特征及电针百会、腰奇和大肠俞穴治疗癫痫的肠道菌群代谢组学机制，为癫痫的诊疗提供新的思路与方法。
方法：
选用黑龙江中医药大学动物实验中心提供的清洁级SD雌性大鼠96只，体重210±20g，适应性喂养一周后随机选取16只作为空白对照组，余80只作为模型点燃组。每天上午10-11点对模型点燃组SD大鼠进行PTZ腹腔注射，剂量为PTZ35mg/kg，16只空白组大鼠在相同的时间给予同等剂量的生理盐水腹腔注射，观察大鼠的行为学变化1小时，根据Ravine分级标准对大鼠癫痫的发作情况进行评价。凡连续出现至少3次惊厥程度达到4级或4级以上的动物视为造模成功用于实验。所有成模大鼠随机分为模型组、丙戊酸钠组、抗生素组、生酮组，电针组每组大鼠16只。除生酮组外余5组以每天每100g大鼠给予15~20gCD饲料，生酮组根据CD饲料每日平均能量摄入量给予同等能量的生酮饲料，自由饮水。每日早09：00开始干预治疗，抗生素干预组：给予万古霉素(50mg/kg)、新霉素(100m g/kg)和甲硝唑(100mg/kg)溶液混合液按10ml/kg灌胃，氨苄西林(1mg/ml)于饮用水中随机提供；丙戊酸钠干预组：按10ml/kg灌入丙戊酸钠溶液（94mg/ml）；电针组：将毫针于百会穴向后平刺0.3寸；腰奇穴向前平刺0.5寸；左右大肠俞穴向下直刺0.6寸，用金属导线连接腰奇穴与左右大肠俞穴针柄并固定。将SDZ-Ⅱ型华佗牌电针治疗仪的正极、负极导线分别连接百会穴及金属导线上。给予的电针刺激参数为100HZ，强度以动物能耐受并保持安静为度，时间为10min；空白组、模型组给予0.9%氯化钠溶液按10ml/kg灌胃对照。治疗14天后采集大鼠粪便并对大鼠粪便进行UHPL C-QTOF-MS非靶标代谢组学检测及16S rDNA的V3+V4区Metagenomic测序。对16SrDNA高通量测序，肠道菌群代谢组原始数据整理并选择合适的生信分析手段进行多元统计分析和单因素统计分析。最终肠道菌群结构生物标志物以LEfSe分析LDA score＞4且P＜0.05为标准筛选，肠道菌群代谢谱生物标志物采用代谢通路拓扑分析和富集分析以Impact＞0.1和（或）P＜0.05为标准筛选。
结果：
1与正常大鼠对比，戊四氮致痫大鼠肠道菌群结构门属水平上的特点及非靶标代谢组学检测结果：
1）16S rDNA分析结果显示：戊四氮致痫大鼠的Alpha多样性差异不显著，Beta多样性变大且差异显著（P＜0.05）。门水平中，疣微菌门（Verruco microbia，M：1.26%，N：0.004%）相对丰度上调（wilcox.test，P＜0.05）；螺旋体门（Spirochaetes，M：0.08%，N：0.62%）相对丰度降低（wilcox.test，P＜0.05）。
2）代谢组学分析结果显示：戊四氮致痫大鼠肠道菌群代谢普中苯丙氨酸、L-酪氨酸、生物素、赖氨酸、脱氧胞苷、脱氧尿苷、脱氧胸苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶等差异性代谢物相对定量值均值与正常大鼠对比均升高，且其命中的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，生物素代谢，苯丙氨酸代谢，嘧啶代谢4条代谢通路满足Impact大于0.1和（或）富集分析显著性P值小于0.05的筛选条件，被扰动明显。
2与正常大鼠对比，抗生素处理组大鼠肠道菌群结构门属水平上的特点及非靶标代谢组学检测结果：
1）16S rDNA分析结果显示：抗生素处理组的Alpha多样性改变明显，其肠道菌群丰度、均匀度及多样性降低明显（P＜0.05）；β多样性变大且差异显著（P＜0.05），组间样本肠道菌群类型轮廓离散趋势极显著。
2）代谢组学分析结果显示：抗生素处理后肠道菌群代谢普中甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，抗坏血酸和醛酸代谢，牛磺酸和低钙氨酸，戊糖磷酸途径代谢为满足Impact大于0.1和（或）富集分析显著性P值小于0.05筛选条件的受扰动最明显的代谢通路。命中的差异性代谢物为胆碱（Chol ine）、甘油酸（Glyceric acid）、甜菜碱（Betaine）、二甲基甘氨酸（Di methylglycine）、甘氨酸（Glycine）、肌酸（Creatine）、抗坏血酸（Asc orbic acid）、半胱氨酸（Cysteic acid）、脱氧核糖（Deoxyribose）、D-核糖（D-Ribose），其中除甘油酸（Glyceric acid）、D-核糖（D-Ribose）外，余差异性代谢物相对定量值均值显著高于相应的正常大鼠肠道菌群代谢组。
3与戊四氮致痫大鼠对比，丙戊酸钠干预组大鼠肠道菌群结构门属水平上的特点及非靶标代谢组学检测结果：
1）16S rDNA分析结果显示：戊四氮致痫大鼠丙戊酸钠干预后，Alpha多样性变化不明显，Beta多样指数变大且差异明显。门水平中，仅Patesciba cteria（V：0.23%，M：0.05%）相对丰度增高且有统计学意义（wilcox.tes t，P＜0.05）。经Lefse分析筛选后最终丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus Acido philus)满足LDA score≥4且P_value＜0.05的卡值标准。
2）代谢组学分析结果显示：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢2条代谢途径及其命中的缬氨酸，丝氨酸差异性代谢产物满足Impact大于0.1和（或）富集分析显著性P值小于0.05的卡值条件。
结论：
1.戊四氮致痫大鼠肠道菌群中普雷沃氏菌属NK3B31组的降低可能与癫痫发作相关。其肠道菌群代谢谱中中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、生物素代谢和嘧啶代谢4条代谢通路呈现显著性改变，苯丙氨酸、L-酪氨酸、生物素、赖氨酸、脱氧胞苷、脱氧尿苷、脱氧胸苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶9个差异性代谢物在通路中具有调控意义。提示这4条代谢通路及其命中的差异性代谢物是区别于正常大鼠受扰较大的代谢通路和潜在的生物标志物，可能具有一定的诊断参考意义。
2.抗生素干预后克雷伯氏菌属、大肠杆菌志贺菌、肠杆菌属、乳酸杆菌属、普雷沃氏菌属-9、普雷沃氏菌属NK3B31组、g_uncultured_bacterium_f_M uribaculaceae、布劳特氏菌属、毛螺菌属NK4A136组可作为区别于正常大鼠肠道菌群结构的生物标志物。甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，抗坏血酸和醛酸代谢，牛磺酸和低钙氨酸代谢，戊糖磷酸途径4条代谢通路及命中的胆碱、甘油酸、甜菜碱、二甲基甘氨酸、甘氨酸、肌酸、抗坏血酸、半胱氨酸、脱氧核糖、D-核糖10个差异性代谢物是抗生素干预组与正常大鼠之间肠道菌群代谢谱中受扰较大的代谢通路和潜在的生物标志物。
3.抗生素干预组对正常大鼠肠道菌群结构干扰范围大于戊四氮致痫大鼠组。两组中部分菌属变化一致，提示普雷沃氏菌属NK3B31组丰度的降低，克雷伯氏菌属，肠杆菌属，艾克曼菌属丰度的升高也许与癫痫易感性相关。但抗生素干预组与戊四氮致痫大鼠组肠道菌群代谢谱中变化显著的代谢通路及差异性代谢物并无交集。
4.丙戊酸钠干预后嗜酸乳酸杆菌可作为区别于戊四氮致痫大鼠肠道菌群结构的生物标志物。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢2条代谢通路及其命中的2个差异性代谢物缬氨酸（L-Va line），丝氨酸（L-Serine）为可作为丙戊酸钠干预戊四氮致痫大鼠后肠道菌群代谢谱中发挥抗癫痫作用的受扰动明显的代谢通路和潜在生物标志物。
5.生酮饮食干预后g_Dubosiella、支原体属、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、普雷沃氏菌属-9、瘤胃菌属、普雷沃氏菌属NK3B31组可作为区别于戊四氮致痫大鼠的肠道菌群生物标志物。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙氨酸代谢，一个叶酸碳池3条代谢通路及其命中的苯丙氨酸，L-酪氨酸2个差异性代谢物可作为KD干预戊四氮致痫大鼠后肠道菌群代谢谱中发挥抗癫痫作用较显著的代谢通路和潜在生物标志物。
6.电针百会、腰奇和大肠俞穴后普雷沃氏菌属-9是能区分戊四氮致痫大鼠肠道菌群结构的生物标志物。牛磺酸和低钙氨酸代谢、组氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、类固醇激素生物合成、维生素B6代谢、烟酸和烟酰胺代谢6条代谢通路呈现出显著改变，7个差异性代谢物左旋-缬氨酸、牛磺酸、磷酸吡哆醛、尿酸、组氨、孕烯醇酮和雌酮在通路中具有重要的调控意义。提示它们可能是电针百会、腰奇和大肠俞穴干预戊四氮致痫大鼠后肠道菌群代谢谱中能明显发挥抗癫痫作用的代谢通路和潜在生物标志物。
7.电针百会、腰奇和大肠俞穴干预组比丙戊酸钠干预组及生酮饮食干预组对戊四氮致痫大鼠肠道菌群代谢谱中差异性代谢物和代谢通路的命中率与覆盖率更高。
通过16S rDNA测序技术及非靶标代谢平台分析戊四氮致痫大鼠肠道菌群结构及其代谢谱的变化，探讨癫痫发作与肠道菌群的内在关系及不同干预方法对戊四氮致痫大鼠肠道菌群结构及其代谢谱的影响，分析癫痫的肠道菌群代谢组学特征及电针百会、腰奇和大肠俞穴治疗癫痫的肠道菌群代谢组学机制，为癫痫的诊疗提供新的思路与方法。
方法：
选用黑龙江中医药大学动物实验中心提供的清洁级SD雌性大鼠96只，体重210±20g，适应性喂养一周后随机选取16只作为空白对照组，余80只作为模型点燃组。每天上午10-11点对模型点燃组SD大鼠进行PTZ腹腔注射，剂量为PTZ35mg/kg，16只空白组大鼠在相同的时间给予同等剂量的生理盐水腹腔注射，观察大鼠的行为学变化1小时，根据Ravine分级标准对大鼠癫痫的发作情况进行评价。凡连续出现至少3次惊厥程度达到4级或4级以上的动物视为造模成功用于实验。所有成模大鼠随机分为模型组、丙戊酸钠组、抗生素组、生酮组，电针组每组大鼠16只。除生酮组外余5组以每天每100g大鼠给予15~20gCD饲料，生酮组根据CD饲料每日平均能量摄入量给予同等能量的生酮饲料，自由饮水。每日早09：00开始干预治疗，抗生素干预组：给予万古霉素(50mg/kg)、新霉素(100m g/kg)和甲硝唑(100mg/kg)溶液混合液按10ml/kg灌胃，氨苄西林(1mg/ml)于饮用水中随机提供；丙戊酸钠干预组：按10ml/kg灌入丙戊酸钠溶液（94mg/ml）；电针组：将毫针于百会穴向后平刺0.3寸；腰奇穴向前平刺0.5寸；左右大肠俞穴向下直刺0.6寸，用金属导线连接腰奇穴与左右大肠俞穴针柄并固定。将SDZ-Ⅱ型华佗牌电针治疗仪的正极、负极导线分别连接百会穴及金属导线上。给予的电针刺激参数为100HZ，强度以动物能耐受并保持安静为度，时间为10min；空白组、模型组给予0.9%氯化钠溶液按10ml/kg灌胃对照。治疗14天后采集大鼠粪便并对大鼠粪便进行UHPL C-QTOF-MS非靶标代谢组学检测及16S rDNA的V3+V4区Metagenomic测序。对16SrDNA高通量测序，肠道菌群代谢组原始数据整理并选择合适的生信分析手段进行多元统计分析和单因素统计分析。最终肠道菌群结构生物标志物以LEfSe分析LDA score＞4且P＜0.05为标准筛选，肠道菌群代谢谱生物标志物采用代谢通路拓扑分析和富集分析以Impact＞0.1和（或）P＜0.05为标准筛选。
结果：
1与正常大鼠对比，戊四氮致痫大鼠肠道菌群结构门属水平上的特点及非靶标代谢组学检测结果：
1）16S rDNA分析结果显示：戊四氮致痫大鼠的Alpha多样性差异不显著，Beta多样性变大且差异显著（P＜0.05）。门水平中，疣微菌门（Verruco microbia，M：1.26%，N：0.004%）相对丰度上调（wilcox.test，P＜0.05）；螺旋体门（Spirochaetes，M：0.08%，N：0.62%）相对丰度降低（wilcox.test，P＜0.05）。
2）代谢组学分析结果显示：戊四氮致痫大鼠肠道菌群代谢普中苯丙氨酸、L-酪氨酸、生物素、赖氨酸、脱氧胞苷、脱氧尿苷、脱氧胸苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶等差异性代谢物相对定量值均值与正常大鼠对比均升高，且其命中的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，生物素代谢，苯丙氨酸代谢，嘧啶代谢4条代谢通路满足Impact大于0.1和（或）富集分析显著性P值小于0.05的筛选条件，被扰动明显。
2与正常大鼠对比，抗生素处理组大鼠肠道菌群结构门属水平上的特点及非靶标代谢组学检测结果：
1）16S rDNA分析结果显示：抗生素处理组的Alpha多样性改变明显，其肠道菌群丰度、均匀度及多样性降低明显（P＜0.05）；β多样性变大且差异显著（P＜0.05），组间样本肠道菌群类型轮廓离散趋势极显著。
2）代谢组学分析结果显示：抗生素处理后肠道菌群代谢普中甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，抗坏血酸和醛酸代谢，牛磺酸和低钙氨酸，戊糖磷酸途径代谢为满足Impact大于0.1和（或）富集分析显著性P值小于0.05筛选条件的受扰动最明显的代谢通路。命中的差异性代谢物为胆碱（Chol ine）、甘油酸（Glyceric acid）、甜菜碱（Betaine）、二甲基甘氨酸（Di methylglycine）、甘氨酸（Glycine）、肌酸（Creatine）、抗坏血酸（Asc orbic acid）、半胱氨酸（Cysteic acid）、脱氧核糖（Deoxyribose）、D-核糖（D-Ribose），其中除甘油酸（Glyceric acid）、D-核糖（D-Ribose）外，余差异性代谢物相对定量值均值显著高于相应的正常大鼠肠道菌群代谢组。
3与戊四氮致痫大鼠对比，丙戊酸钠干预组大鼠肠道菌群结构门属水平上的特点及非靶标代谢组学检测结果：
1）16S rDNA分析结果显示：戊四氮致痫大鼠丙戊酸钠干预后，Alpha多样性变化不明显，Beta多样指数变大且差异明显。门水平中，仅Patesciba cteria（V：0.23%，M：0.05%）相对丰度增高且有统计学意义（wilcox.tes t，P＜0.05）。经Lefse分析筛选后最终丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus Acido philus)满足LDA score≥4且P_value＜0.05的卡值标准。
2）代谢组学分析结果显示：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢2条代谢途径及其命中的缬氨酸，丝氨酸差异性代谢产物满足Impact大于0.1和（或）富集分析显著性P值小于0.05的卡值条件。
结论：
1.戊四氮致痫大鼠肠道菌群中普雷沃氏菌属NK3B31组的降低可能与癫痫发作相关。其肠道菌群代谢谱中中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、生物素代谢和嘧啶代谢4条代谢通路呈现显著性改变，苯丙氨酸、L-酪氨酸、生物素、赖氨酸、脱氧胞苷、脱氧尿苷、脱氧胸苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶9个差异性代谢物在通路中具有调控意义。提示这4条代谢通路及其命中的差异性代谢物是区别于正常大鼠受扰较大的代谢通路和潜在的生物标志物，可能具有一定的诊断参考意义。
2.抗生素干预后克雷伯氏菌属、大肠杆菌志贺菌、肠杆菌属、乳酸杆菌属、普雷沃氏菌属-9、普雷沃氏菌属NK3B31组、g_uncultured_bacterium_f_M uribaculaceae、布劳特氏菌属、毛螺菌属NK4A136组可作为区别于正常大鼠肠道菌群结构的生物标志物。甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，抗坏血酸和醛酸代谢，牛磺酸和低钙氨酸代谢，戊糖磷酸途径4条代谢通路及命中的胆碱、甘油酸、甜菜碱、二甲基甘氨酸、甘氨酸、肌酸、抗坏血酸、半胱氨酸、脱氧核糖、D-核糖10个差异性代谢物是抗生素干预组与正常大鼠之间肠道菌群代谢谱中受扰较大的代谢通路和潜在的生物标志物。
3.抗生素干预组对正常大鼠肠道菌群结构干扰范围大于戊四氮致痫大鼠组。两组中部分菌属变化一致，提示普雷沃氏菌属NK3B31组丰度的降低，克雷伯氏菌属，肠杆菌属，艾克曼菌属丰度的升高也许与癫痫易感性相关。但抗生素干预组与戊四氮致痫大鼠组肠道菌群代谢谱中变化显著的代谢通路及差异性代谢物并无交集。
4.丙戊酸钠干预后嗜酸乳酸杆菌可作为区别于戊四氮致痫大鼠肠道菌群结构的生物标志物。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢2条代谢通路及其命中的2个差异性代谢物缬氨酸（L-Va line），丝氨酸（L-Serine）为可作为丙戊酸钠干预戊四氮致痫大鼠后肠道菌群代谢谱中发挥抗癫痫作用的受扰动明显的代谢通路和潜在生物标志物。
5.生酮饮食干预后g_Dubosiella、支原体属、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、普雷沃氏菌属-9、瘤胃菌属、普雷沃氏菌属NK3B31组可作为区别于戊四氮致痫大鼠的肠道菌群生物标志物。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙氨酸代谢，一个叶酸碳池3条代谢通路及其命中的苯丙氨酸，L-酪氨酸2个差异性代谢物可作为KD干预戊四氮致痫大鼠后肠道菌群代谢谱中发挥抗癫痫作用较显著的代谢通路和潜在生物标志物。
6.电针百会、腰奇和大肠俞穴后普雷沃氏菌属-9是能区分戊四氮致痫大鼠肠道菌群结构的生物标志物。牛磺酸和低钙氨酸代谢、组氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、类固醇激素生物合成、维生素B6代谢、烟酸和烟酰胺代谢6条代谢通路呈现出显著改变，7个差异性代谢物左旋-缬氨酸、牛磺酸、磷酸吡哆醛、尿酸、组氨、孕烯醇酮和雌酮在通路中具有重要的调控意义。提示它们可能是电针百会、腰奇和大肠俞穴干预戊四氮致痫大鼠后肠道菌群代谢谱中能明显发挥抗癫痫作用的代谢通路和潜在生物标志物。
7.电针百会、腰奇和大肠俞穴干预组比丙戊酸钠干预组及生酮饮食干预组对戊四氮致痫大鼠肠道菌群代谢谱中差异性代谢物和代谢通路的命中率与覆盖率更高。